Seite 2
I
A
NALYSE DER
G
RANULOZYTENFUNKTION UND DES
CD45R-
E
XPRESSIONSMUSTERS SOWIE
F
REQUENZBESTIMMUNG EINER
DEFINIERTEN
CD45-P
UNKTMUTATION BEI
P
ATIENTEN MIT
A
UTOIMMUNTHYREOIDITIS VOM
T
YP
H
ASHIMOTO
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)
vorgelegt dem Rat der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Schiller-Universität Jena
von
Sina Weißenborn
Seite 3
II
Gutachter:
1. Prof. Dr. med. Dagmar Barz, Institut für Transfusionsmedizin, Jena
2. Prof. Dr. med. Ulrich-Alfons Müller, Klinik für Innere Medizin III, Jena
3. Prof. Dr. med. Gregor Bein, Institut für Transfusionsmedizin, Gießen
Tag der öffentlichen Verteidigung: 06.01.2009
Seite 4
Abkürzungsverzeichnis
I
Abkürzungsverzeichnis
. Signifikanzniveau
ADCC engl.
antibody-dependend
cellular cytotoxity
AG Antigen/-e
AIK Autoimmunerkrankung/-en
AIT Autoimmunthyreoiditis
AK Antikörper
APC engl.
antigen-presenting cell/-s
CD
engl. cluster of differentiation
CD45RA-C;O
Bezeichnung für die Epitope (A, B, C, O) der CD45-
Isoformen; CD45RA-C werden durch die Exone A-C
kodiert
CÆG
Basenaustausch in der DNA: Cytosin wurde durch
Guanin ersetzt
DNA engl.
desoxyribonucleinacid
dNTP Desoxy-Nukleosidtriphosphate
ESS
engl. exonic splicing silencer
FACS
engl. fluorescence-activated cell sorter
FITC Fluoreszein-Isothiozyanat
FL Fluoreszenz
FSC
engl. forward scatter; Vorwärtsstreulicht
FSU
Friedrich Schiller Universität
G1-3
Gate (=Analysefenster) Nummer 1-3
GFT Granulozytenfunktionstest
HCV
Hepatitis C Virus
HIV
engl. human immunodeficiency virus
HLA
engl. human leukocyte antigen
HT Hashimoto-Thyreoiditis
IFN Interferon
Ig Immunglobulin/-e
IL Interleukin/-e
Seite 5
Abkürzungsverzeichnis
II
KIM
Klinik für Innere Medizin
LPAP
engl. lymphocyte phosphatase-associated
phosphoprotein
mAK monoklonale/-r
Antikörper
MHC
engl. major histocompatibility complex
MS Multiple
Sklerose
MspI Moraxella
Spezies
I
MW Molekulargewicht/-e
p
statistische Überschreitungswahrscheinlichkeit von .
PBS
engl. phosphate buffered saline
PCR
engl. polymerase chain reaction
PE Phycoerythrin
RFLP Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus
RNA engl.
ribonucleinacid
SKAP55 engl.
src-kinase-associated phosphoprotein of 55kD
SLE
Systemischer Lupus Erythematodes
SR
Serin (S), Arginin (R)
SSC
engl. side scatter; Seitwärtsstreulicht
Taq Thermus
aquaticus
Tg Thyroglobulin
TNF Tumornekrosefaktor
TPO Thyroidperoxidase
TSH
Thyroid stimulierendes Hormon
TZR T-Zellrezeptor
vs. versus
ZAP engl.
zeta-associated
protein
Seite 6
Inhaltsverzeichnis
III
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis.....................................................................................I
Inhaltsverzeichnis............................................................................................III
1
Zusammenfassung......................................................................................1
2
Einleitung .....................................................................................................3
2.1
Autoimmunthyreoiditis Typ Hashimoto...................................................3
2.1.1
Epidemiologie..................................................................................3
2.1.2
Klinik................................................................................................4
2.1.3
Diagnostik .......................................................................................5
2.1.4
Prognose.........................................................................................5
2.1.5
Therapie ..........................................................................................5
2.1.6
Ätiologie und Pathogenese .............................................................6
2.2
CD45-Molekül ........................................................................................8
2.2.1
Aufbau.............................................................................................9
2.2.2
Funktion ........................................................................................10
2.2.3
Regulation des CD45 ....................................................................11
2.2.4
Alternatives Spleißen und genetische Polymorphismen................12
2.2.5
Bindung der CD45R-AK ................................................................15
2.2.6
CD45 und Autoimmunerkrankungen .............................................15
3
Fragestellung und Ziele ............................................................................17
4
Material.......................................................................................................18
4.1
Probanden............................................................................................18
4.1.1
Patientenkollektiv ..........................................................................18
4.1.2
Kontrollkollektiv .............................................................................18
4.2
Materialien............................................................................................19
4.2.1
Antikörper......................................................................................20
4.2.2
weitere Chemikalien ......................................................................21
4.2.3
Verbrauchsmaterialien ..................................................................22
4.2.4
Geräte ...........................................................................................23
4.2.5
Software ........................................................................................23
Seite 7
Inhaltsverzeichnis
IV
5
Experimentelle Methoden .........................................................................24
5.1
Herstellung von Lösungen....................................................................24
5.1.1
Herstellung von PBS .....................................................................24
5.1.2
Herstellung der Lyselösung...........................................................24
5.2
Durchflusszytometrische Analytik.........................................................24
5.2.1
Grundlagen der Durchflusszytometrie ...........................................24
5.2.2
Einstellungen des Durchflusszytometers.......................................26
5.2.3
Anfärbung der CD45-AG von Leukozyten mit CD45-mAK ............27
5.2.4
Isotypkontrollen für die verwendeten CD45-AK.............................28
5.2.5
Bestimmung der Phagozytoseaktivität von Granulozyten .............28
5.3
DNA-Analytik........................................................................................30
5.3.1
Präparation der DNA aus Vollblut..................................................30
5.3.2
Nachweis der CÆG Punktmutation an Position 77 des Exon A
des CD45-Gens ............................................................................31
6
Statistische Methoden...............................................................................37
6.1
Statistik CD45R-Expressionsmuster .................................................37
6.2
Statistik Granulozytenfunktion...........................................................37
6.3
Statistik Mutationshäufigkeit..............................................................38
7
Ergebnisse .................................................................................................39
7.1
Altersstruktur und Geschlechtsverhältnis in den Kollektiven ................39
7.2
Durchflusszytometrische Darstellung der Leukozytenpopulationen .....40
7.3
Ergebnisse der Isotypkontrollen ...........................................................41
7.4
Grundlagen der CD45RO/RA-Expression auf Lymphozyten und
Granulozyten........................................................................................43
7.4.1
Charakterisierung eines varianten CD45RA-Expressionsmusters
in der Lymphozytenpopulation ......................................................44
7.4.2
Charakterisierung eines varianten CD45RA-Expressionsmusters
in der Granulozytenpopulation ......................................................45
7.5
Verteilung des klassischen und varianten CD45RA-Expressions-
musters in den Kollektiven ...................................................................48
Seite 8
Inhaltsverzeichnis
V
7.6
Molekulargenetische Resultate ............................................................48
7.6.1
Nachweis des PCR-Produktes für Exon A des CD45-Gens..........48
7.6.2
Nachweis der gesuchten Punktmutation durch RFLP-Analyse .....49
7.6.3
Gegenüberstellung der Allelfrequenzen ........................................53
7.7
Vergleich der klassischen mit den varianten CD45RA-Expressions-
mustern ................................................................................................54
7.7.1
CD45RO- und CD45RA-Expression auf Lymphozyten .................54
7.7.2
CD45RB- und CD45RC-Expression auf Lymphozyten..................56
7.7.3
CD45RO- und CD45RA-Expression auf Granulozyten .................56
7.7.4
CD45RB- und CD45RC-Expression auf Granulozyten..................58
7.8
Vergleich des Patienten- und Kontrollkollektivs unter Ausschluss der
Träger des C77G-Polymorphismus ......................................................58
7.8.1
CD45RO- und CD45RA-Expression auf Lymphozyten .................59
7.8.2
CD45RB- und CD45RC-Expression auf Lymphozyten..................60
7.8.3
CD45RO- und CD45RA-Expression auf Granulozyten .................60
7.8.4
CD45RB- und CD45RC-Expression auf Granulozyten..................61
7.9
Darstellung der Phagozytoseaktivität der Granulozyten.......................62
8
Diskussion .................................................................................................67
8.1
Allelfrequenz ........................................................................................67
8.2
Diskussion der Ergebnisse zwischen Personen mit varianten und
normalen CD45RA-Expressionsmustern.............................................. 70
8.2.1
CD45R-Expression auf Lymphozyten ...........................................70
8.2.2
CD45R-Expression auf Granulozyten ...........................................73
8.3
Diskussion der Ergebnisse zwischen Patienten- und Kontrollkollektiv
unter Ausschluss der Träger des C77G-Polymorphismus.................... 76
8.3.1
CD45R-Expression auf Lymphozyten ...........................................76
8.3.2
CD45R-Expression auf Granulozyten ...........................................77
8.4
Granulozytenfunktionstest....................................................................78
9
Schlussfolgerungen ..................................................................................82
10
Literatur- und Quellenverzeichnis............................................................83
11
Anhang .......................................................................................................93
Seite 9
1 Zusammenfassung
1
1 Zusammenfassung
Hintergrund: Lymphozyten exprimieren, je nach Aktivierungszustand,
verschiedene Isoformen des CD45-Moleküls. Dies ist durch alternatives
Spleißen der Exone A-C des CD45-Gens möglich. Inaktive T-Zellen prägen die
Isoformen ABC, AB, BC und B aus. Nach der Aktivierung sind nur noch die
Isoformen O und B auf der Zelloberfläche präsent. Durch eine CÆG
Transversion an Position 77 des Exon A exprimieren aktive T-Zellen zusätzlich
die Isoform AB. Die Transversion kann mit Autoimmunerkrankungen (AIK)
assoziiert sein. Ein Einfluss der Punktmutation auf die Granulozytenfunktion ist
bisher nicht beschrieben. Granulozyten beugen durch ihre Phagozytose-
fähigkeit Infektionen vor, welche in der Ätiologie von AIK eine Rolle spielen. Sie
exprimieren im Ruhezustand die Isoform O des CD45-Moleküls. Nach
Zellaktivierung werden durch die Verschmelzung intrazellulärer Granula
Isoformen mit Exon A kodierenden Sequenzen an die Zelloberfläche
transloziert.
Fragestellungen: Besteht eine Assoziation des C77G-Polymorphismus zur
Hashimoto-Thyreoiditis (HT)? Wie verändert der C77G-Polymorphismus die
CD45R-Expression auf Lympho- und Granulozyten? Treten Unterschiede in der
CD45R-Expression bei HT-Patienten im Vergleich zu Kontrollpersonen auf? Übt
die CÆG Transversion Einfluss auf die Phagozytoseaktivität der Granulozyten
aus? Ist die Phagozytoseaktivität zwischen den Kollektiven unterschiedlich?
Methoden: Bei 73 HT-Patienten und 73 Kontrollprobanden wurde das CD45R-
Expressionsmuster der Leukozyten mit einem CD45RA-, -RB-, -RC- und -RO-
AK im Durchflusszytometer analysiert. Sämtliche Probanden der Studie wurden
auf die CÆG Transversion mit einer PCR-RFLP-Analyse getestet. Die
Phagozytoseaktivität wurde von 41 HT-Patienten und 42 Kontrollprobanden
mithilfe des kommerziell erhältlichen Testkits ,,Phagotest" ermittelt.
Ergebnisse: Ein variantes CD45RA-Expressionsmuster - dem CÆG
Polymorphismus typisch - wurde in beiden Kollektiven je einmal beobachtet. Die
molekulargenetischen Untersuchungen bestätigten die Transversion an Position
77 des Exon A bei beiden Trägern des veränderten CD45RA-Musters. Die G-
Allelfrequenz ergab einen Wert von 0,69%. Ein Unterschied zwischen den
Kollektiven war somit statistisch nicht vorhanden.
Seite 10
1 Zusammenfassung
2
Das CD45RA-Expressionsmuster zeigte bei den Personen mit der Transversion
im Vergleich zu den Individuen mit dem klassischen CD45RA-Muster folgende
statistisch signifikante Veränderungen: Erhöhte Lymphozytenzahl mit
CD45RO
,
/RA
+
- und CD45RC
+
-Markierung, sowie in beiden
Leukozytenpopulationen gesteigerte Zahl CD45RO
+
/RA
+
- und erniedrigte
Mengen CD45RO
+
/RA
,
-Zellen. In der Gegenüberstellung der HT- mit den
Kontrollprobanden unter Ausschluss der gefundenen Träger der Punktmutation
ergaben sich signifikante Differenzen bzgl. der gesteigerten CD45RA- und
CD45RC-Expression auf Lymphozyten sowie der reduzierten CD45RO
+
- und
CD45RO
+
/RA
,
-Lymphozytenzahl im Kontrollkollektiv. Weiterhin war eine
gesenkte CD45RB-Expression auf Granulozyten in dieser Gruppe vorhanden.
Im Granulozytenfunktionstest (GFT) wurde nach Feststellung der Punktmutation
bei einem der untersuchten Kontrollprobanden eine Gegenüberstellung dieser
Person mit den restlichen Kontroll- und HT-Personen durchgeführt. Es zeigte
sich eine erhöhte Phagozytoseaktivität an den ersten beiden Messpunkten
('10min Eisbad' und '1min im 37°C warmen Wasser') bei dem Individuum mit
dem varianten CD45-Expressionsmuster im Vergleich mit den beiden anderen
Personengruppen. An den genannten Messpunkten zeigte die
Gegenüberstellung der Zellen von HT-Patienten mit denen der gesunden
Spender eine signifikante Reduktion der Granulozytenaktivität im
Patientenkollektiv. Im weiteren Untersuchungsverlauf nährten sich die
Aktivitäten der Granulozyten in den Kollektiven an.
Schlussfolgerungen: Eine Assoziation zwischen dem C77G-Polymorphismus
und der HT besteht nicht. Die gefundenen Differenzen in der CD45RO- und
CD45RA-Expression lassen sich zum einen durch die C77G-Transversion
erklären, zum anderen könnte die ständig ablaufende Immunreaktion bei den
HT-Patienten verantwortlich sein. Die festgestellten Quantitätsunterschiede der,
durch die Exone A-C kodierten Sequenzen in den Kollektiven könnten bei
entsprechender Bestätigung in weiteren Studien ein Diagnosekriterium
darstellen. Zudem gibt die veränderte Phagozytoseaktivität zwischen den
untersuchten Gruppen einen Hinweis auf einen Einfluss der CD45-Isoformen
auf diese Granulozytenfunktion. Bestätigt sich dieser Verdacht in weiteren
Untersuchungen wären auch Modulationen der CD45-Isoformen und der damit
verbunden Zellfunktion durch AK denkbar.
Seite 11
2 Einleitung
3
2 Einleitung
2.1 Autoimmunthyreoiditis Typ Hashimoto
Die Schilddrüse ist ein Organ mit einem vielfältigen Einfluss auf sämtliche
Körperfunktionen und erstreckt sich vom Kohlenhydrat-, Fett-, und
Proteinstoffwechsel über die Thermoregulation und das Herz-Kreislaufsystem
auf den Magen-Darmtrakt sowie das Muskel- und Nervensystem. Durch diese
multiplen Funktionen wird die gesamte körperliche, geistige und seelische
Entwicklung und Verfassung des Menschen grundlegend beeinflusst.
Fehlfunktionen können mit einem Überschuss an Schilddrüsenhormonen
(Hyperthyreose) oder einem Hormonmangel (Hypothyreose) einhergehen. Die
Ursachen können in drei Ebenen liegen. Sie können sich im Hypothalamus
(tertiär), in der Hypophyse (sekundär) oder der Schilddrüse direkt (primär)
befinden. Primäre Ursachen liegen u.a. bei den, im Folgenden beschriebenen,
Erkrankungen, Morbus Basedow und Hashimoto-Thyreoiditis (HT), vor.
Die meisten Hyperthyreosen werden durch die AIK Morbus Basedow
verursacht. Dabei führen schilddrüsenstimulierende AK zur erhöhten
Hormonausschüttung. In wenigen Fällen ist eine Schilddrüsenautonomie für das
unausgewogene Hormonverhältnis verantwortlich.
Auch für Hypothyreosen sind mehrere Ursachen bekannt. Neben iatrogenen
Veränderungen z.B. durch Strumektomie oder Radiotherapie können auch AIK
zum Hormonmangel führen. Die hier untersuchte AIK - chronisch lymphozytäre
Hashimoto-Thyreoiditis geht mit einer Entzündung der Schilddrüse einher. Sie
wurde erstmals 1912 von dem japanischen Pathologen und Chirurgen Hakaru
Hashimoto beschrieben (Sawin 2002) und stellt die häufigste AIT dar (Schott
und Scherbaum 2006). Diese Erkrankung soll nun näher erläutert werden.
2.1.1 Epidemiologie
Eine Untersuchung in der nordamerikanischen Bevölkerung ergab, dass 10%
der untersuchten Personen erhöhte Schilddrüsen-AK aufweisen, von denen 5%
eine Hypothyreose (0,3% eine manifeste Hypothyreose) zeigen (Hollowell et al.
2002). Neuere Studien postulieren eine 10%-ige Häufigkeit von klinischen und
subklinischen Hypothyreosen. Diese Zahl kann auch für Westeuropa
übernommen werden (Parle et al. 1991, Valeix et al. 2004). Dabei sind Frauen
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