Adaptation und Phosphorylierung in Cyanobakterien

Inhaltsverzeichnis

  Seite  

  A. Einleitung  3

  B. Kompensatorische Phosphorylierung  4

I.  Reversible Phosphorylierung als Grundlage  4

1.  Massenwirkungskinetik  6

2.  Michaelis-Menten Kinetik  7

  a. Einstellung des Fließgleichgewichts  8

  b. Veränderung von v 1 und v 2  9

  c. Signalantwortverhalten  9

II.  Beeinflussbarkeit der Konzentration des aktiven Enzyms  10

III.  Kompensation von Konzentrationsschwankungen  12

1.  Unabhängigkeit von K/P durch Bifunktionalität  12

2.  Unabhängigkeit von E T durch Autokatalyse  13

3.  Unabhängigkeit von E T durch einseitige Sättigung  14

  a. Heuristisches Modell mit Michaelis-Menten Kinetik  14

  b. Problematik der Anwendung von Michaelis-Menten Kinetik  16

  c. Anwendung von Massenwirkungskinetik bei zwei Bindungsstellen  17

  aa. Kinaseaktivität des Dreierkomplexes und geordnete Bindung  17

  bb. Kinase- und Phosphataseaktivität sowie ungeordnete Bindung  19

IV.  Kompensatorische Phosphorylierung in E coli und Cyanobakterien  20

1.  Glyoxylatabzweigung in E coli  20

2.  Glyoxylatabzweigung in Cyanobakterien  22

3.  Pyruvatdehydrogenasekomplex in Cyanobakterien  22

  C. Zweikomponentensysteme  24

I.  Mechanismus der Invarianz  24

II.  Vorkommen in E coli und in Cyanobakterien  26

  D. Multiple Phosphorylierung in zweikomponentigen Systemen  28

I.  Multiple Phosphorylierung  28

II.  Regulation der Glutaminsynthetase über PII in E coli  28

III.  Regulation von PII und der Glutaminsynthetase in Cyanobakterien  31

  E. Zusammenfassung  32

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A. Einleitung

Homöostase ist eine wichtige Eigenschaft aller Lebewesen. Durch Anpassung an veränderte Umweltbedingungen, gelingt es dem Organismus die Schwankungen in seiner Umgebung auszugleichen. Im Laufe der Evolution haben sich Möglichkeiten entwickelt, auf kurzfristige und langfristige Veränderungen der Umwelt adäquat zu reagieren. Es hat sich dabei herausgestellt, dass der posttranslationalen Veränderung von Proteinen wie der Phosphorylierung bei vielen Anpassungsprozessen eine bedeutende Rolle zukommt ¹ . Um eine genaue Regulierung sicherzustellen tritt bei all diesen Vorgängen eine Kompensation von Schwankungen der beteiligten Komponenten auf. Während über Phosphorylierungen und deren Invarianz beim Menschen und E.coli einiges bekannt ist, weiß man bisher nur relativ wenig darüber in Cyanobakterien. Dieser Aufsatz stellt exemplarisch einzelne Phosphorylierungsmethoden sowie deren robuste Regulierung bei E.coli vor und vergleicht sie mit dem bekannten Wissen über derartige Vorgänge in Cyanobakterien.

Phosphorylierungen sind die wichtigsten Regulierungsmechanismen in Zellen. Am bekanntesten ist der MAP-Kinaseweg mit mindestens drei sich nacheinander phosphorylierenden Kinasen ² . Der MAP-Kinaseweg ist unter anderem an der Regulation der Embryogenese, der Zelldifferenzierung, des Zellwachstums und des Programmierten Zelltodes beteiligt.

Durch reversible Phosphorylierung werden Proteine in Stoffwechselprozessen zur Dirigierung von Verzweigungen oder in Adaptationsprozessen wie der Chemotaxis an- und abgeschaltet. Grund für den diskreten Aktivierungsprozess ist die bei bestimmten Parametern auftretende Ultrasensitivität des zu aktivierenden Proteins auf ein externes Signal ³ . Es ist der Zelle dadurch möglich, genau zwischen zwei unterschiedlichen Zuständen zu unterscheiden. Dies gilt nicht nur für die kurzfristige, sondern auch für die langfristige Einstellung auf Umweltveränderungen durch Genaktivierung. Bei der langfristigen Antwort registriert in so genannten Zweikomponentensystemen eine Sensorkinase in der Membran bestimmte Botenstoffe, phosphoryliert sich und überträgt die Phosphorylgruppe auf einen Regulator, der dann meist Gene aktiviert oder deaktiviert ⁴ . Beispielsweise werden dadurch Porenproteine synthetisiert, mit deren Hilfe bestimmte neu im Milieu vorhandene Stoffe aufgenommen und verwertet werden können.

Kurz- und langfristige Regulierung unterscheiden sich in ihrer Geschwindigkeit und ihrer Nachhaltigkeit. Die langfristige Antwort erfordert durch Transkription und Translation mehr Zeit als die kurzfristige Antwort, bei der lediglich Phosphorylgruppen verknüpft und abgetrennt werden. Dafür

¹ Kennelly et al. 1999.

² Pearson et al. 2001.

³ Goldbeter et al. 1981.

⁴ Stock et al. 1989.

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stehen bei der langfristigen Antwort die neusynthetisierten Proteine für längere Zeit zur Verfügung, bevor sie dann proteolytisch wieder abgebaut werden.

Beide Methoden haben gemeinsam, dass sie gemessen an ihrem Eingabe-/Ausgabeverhältnis immer gleich erfolgen müssen, da die Antwort nicht von der Konzentration einer beteiligten Komponente abhängen soll. Denn diese neigen in der Zelle unter anderem wegen des ungerichteten Transports und ungleichen Zellteilungen zu starken Schwankungen ⁵ . Um dennoch Ressourcenverbrauch, wie er sich zum Beispiel bei überhöhter Nutzung des Transkriptionsapparates bemerkbar machen würde, und Fehlleitungen etwa bei Verzweigungen entgegenzuwirken, muss die Zelle über Mechanismen zur präzisen und konstanten Regelung verfügen.

In dieser Arbeit soll aufgezeigt werden, wie Cyanobakterien durch Phosphorylierung lang- und kurzfristig auf Umweltveränderungen reagieren und wie sie sich an interne sowie externe Schwankungen anpassen. Zu diesem Zweck werden sowohl die kurzfristig wirkende Kompensatorische Phosphorylierung als auch Zweikomponentensysteme zur langfristigen Anpassung an mehreren Beispielen besprochen. Im Anschluss daran werden Zweikomponentensysteme mit multiplen Phosphorylierungen erklärt. Ausgangspunkt der Untersuchungen ist in jedem Fall E.coli, da es im Vergleich zu Cyanobakterien besser untersucht ist.

B. Kompensatorische Phosphorylierung

Kompensatorische Phosphorylierung ist der Ausgleich von Konzentrationsschwankungen durch reversible Phosphorylierung ⁶ . Für das Verständnis der kompensatorischen Wirkung sind daher zunächst die grundlegenden Eigenschaften der reversiblen Phosphorylierung zu untersuchen. Davon ausgehend werden die beiden bisher bekannten Möglichkeiten der Erhaltung konstanter Konzentrationen des aktiven Enzyms vorgestellt. Es handelt sich dabei um Autokatalyse und um einseitige Sättigung einer der beiden Reaktionen.

I. Reversible Phosphorylierung als Grundlage

In der einfachsten Form der Phosphorylierungsmöglichkeiten wird ein Protein durch Dephosphorylierung mittels einer Phosphatase aktiviert und durch Phosphorylierung mittels einer Kinase deaktiviert (Grafik 1) bzw. umgekehrt. Bei diesem Mechanismus wird insgesamt mehr von dem benötigten Enzym produziert, aber nur ein bestimmter Teil durch Phosphorylierung aktiviert. Auf diese Art und

⁵ Kaufmann et al. 2007.

⁶ LaPorte et al. 1985.

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Weise kann sich die Zelle schnell auf wechselnde Umweltbedingungen einstellen, indem sie einfach das Protein durch ein Signal an die Kinase bzw. Phosphatase ein- und ausschaltet.

^k P - Geschwindigkeitskonstante der Phosphatasereaktion

^k K - Geschwindigkeitskonstante der Kinasereaktion

K

Grafik 1: Signalinduzierte reversible Dephosphorylierung zur Aktivierung von Protein E.

Die reversible Phosphorylierung, wie sie hier dargestellt ist, ist chemisch gesehen eine so genannte O-Phosphorylierung. Als O-Phosphorylierung wird die ATP-abhängige Phosphorylierung von Serin-, Threonin- und Tyrosinresten unter Ausbildung einer Phosphomonoesterbindung bezeichnet. Diese Art der Phosphorylierung wurde zuerst in Eukaryonten entdeckt. Die Bedeutung in Bakterien und Archaea tritt aufgrund biochemischer und genomischer Analysen zunehmend zutage. Die O-Phosphorylierung spielt in Cyanobakterien eine wichtige Rolle bei Adaptionsprozessen unter verschiedenen Bedingungen wie z.B. bei verschiedenen Beleuchtungen, bei Salzstress, bei der Heterocystenbildung und bei unterschiedlichen Nährstoffangeboten ⁷ . In Cyanobakterien wurden diverse Serin-, Threonin- und Tyrosinkinasen und -phosphatasen identifiziert ⁸ . Ihre physiologischen Bedeutungen sind aber bisher nicht bekannt. Die komplette Sequenzierung des Genoms von Anabaena variabilis zeigte 76 putative Kinasen und Phosphatasen auf ⁹ . Das ist bisher die größte Anzahl unter den prokaryontischen Genomen und lässt auf komplexe Signaltransduktionen schließen. Die Dynamik von Signalübertragungsketten (Kinetik) wird gemeinhin durch Differentialgleichungen dargestellt. Im Folgenden werden auf die reversible Phosphorylierung in Grafik 1 zwei verschiedene Differentialgleichungen angewendet. Die Massenwirkungskinetik beruht auf einfacher Stöchiometrie, während die Michaelis-Menten-Kinetik darauf aufbauend noch die Möglichkeit der Sättigung an einem Enzym-Substrat-Komplex berücksichtigt.

⁷ Sanders et al. 1989; Hagemann et al. 1993; Mann 1994.

⁸ Zhang et al. 2005.

⁹ Zhang et al. 2005, Table 1.

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1. Massenwirkungskinetik

Unter Außerachtlassung des Signals ergibt sich für Grafik 1 folgende Differentialgleichung mit Massenwirkungskinetik:

(1)

Die Einstellung des Fließgleichgewichts lässt sich mittels Matlab darstellen ¹⁰ (Grafik 2):

Die Veränderungen von v P bei verschiedenen Signalstärken (S 1 2 3 ) und die Veränderungen von v K in dem System (1) (Grafik 1) können in Abhängigkeit von E a (bzw. t) separat betrachtet werden (Grafik 3):

Mit steigendem E a verlagert sich der Fluss zu v K , welches proportional ansteigt, während v P indirekt proportional abnimmt. Mit steigender Signalstärke wird die Abnahme von v P (S) verstärkt. Die Schnittpunkte von v P und v K in Grafik 3 stellen die Fließgleichgewichte dar. An diesen Stellen gilt: v K = v P . Daraus folgt in (1):

¹⁰ Anhang zu Grafik 2.

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und für E a gilt im Fließgleichgewicht:

Die aktive Konzentration des Proteins hängt im Fließgleichgewicht demnach von den Verhältnissen

k P P

, K und von E direkt ab.

k K

2. Michaelis-Menten-Kinetik

Die Michaelis-Menten-Kinetik berücksichtigt, dass bei enzymatisch katalysierten Reaktionen sich immer ein Enzym-Substrat-Komplex bildet. Durch die Komplexbildung ist es möglich, dass bei Überfluss des Substrates eine Sättigung an der Bindungsstelle des Enzyms eintritt und dadurch eine Höchstgeschwindigkeit v max = k cat ·E T nicht überschritten wird. Diese Kinetik findet sich aufgrund der daraus resultierenden Regulierbarkeit durch E T und der Unabhängigkeit von Schwankungen an vielen enzymatisch gesteuerten Stoffwechselwegen.

Durch Anwendung von Michaelis-Menten-Kinetik ergibt sich für die Aktivierung in Grafik 1 folgendes Schema, wenn man annimmt, dass ein Enzym B sowohl phosphoryliert als auch dephosphoryliert ¹¹ :

(2) E a + K

k 4

Es werden die sich bildende Enzym-Substrat-Komplexe E a K und EK berücksichtigt. Die entsprechende Differentialgleichung ist:

(3)

¹¹ Shinar et al. 2009.

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a. Einstellung des Fließgleichgewichts

In dem von Gleichung (2) beschriebenen System, stellt sich mit der Zeit ein Fließgleichgewicht ein (Grafik 4) ¹² :

Das Fließgleichgewicht kann man durch Variation der Parameter in (3) ändern (Grafik 5) ¹³ :

Grafik 5: Einstellung des Fließgleichgewichts von E a bei verschiedenen Konzentrationen der Phosphatase P.

Um die vollständige Abhängigkeit des Fließgleichgewichts von P zu erhalten, muss Gleichung (3) im ^P = K ^{m K} = K m ) zu: Fließgleichgewicht umgestellt werden (mit K m

² +k P ·P·K m *E a -k P ·P·E a +k P ·P·E ^{a 2} -k P ·P·K m 0 = k K ·K·K m ·E a +k K ·K·E a -k K ·E a

Mit dem Befehl „fzero“ kann in Matlab die Nullstelle numerisch berechnet werden. Wenn man dies mehrmals hintereinander für verschiedene P ausführt, erhält man ein Feld mit den jeweiligen Fließ-

¹⁴ : gleichgewichten von E a

¹² Anhang zu Grafik 4.

¹³ Anhang zu Grafik 5.

¹⁴ Anhang zu Grafik 6.

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