Die Umsatzrate der AMP-Desaminase im Meerschweinchenherzen

Als Inauguraldissertation gedruckt mit Genehmigung

der Medizinischen Fakultät der

Heinrich-HeineUniversität Düsseldorf

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Meiner Familie

Abkürzungen

  ADA Adenosin-Desaminase  

  ADP Adenosindiphosphat  

  AMP Adenosinmonophosphat  

  AMPD AMP-Desaminase  

  AOPCP alpha,beta-Methylen-Adenosin-5'-diphosphat  

  ATP Adenosintriphosphat  

  BSA Bovines Serumalbumin  

  cAMP cyclisches 3´, 5´-Adenosinmonophosphat  

  cDNA komplementäre DNA  

  CoA Coenzym A  

  EHNA Erythro-9-(2-Hydroxy-3-nonyl)adenin  

  GDP Guanosindiphosphat  

  GMP Guanosinmonophosphat  

  GTP Guanosintriphosphat  

  HGPRT Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase  

  HPLC High Pressure Liquid Chromatography  

  IDP Inosindiphosphat  

  IMP Inosinmonophosphat  

  ITP Inosintriphosphat  

  kDa Kilo-Dalton  

  KHB Krebs-Henseleit-Puffer  

  Ki Dissoziationskonstante für einen Enzym-Inhibitor-Komplex  

  K M Michaelis-Konstante  

  NMR Nuclear Magnetic Resonance  

  NO Nitric oxide (Stickstoffmonoxid)  

  Pi anorganisches Phosphat  

  PRPP 5-Phospho-ribosyl-1-diphosphat  

  SAH S-Adenosyl-L-Homocystein  

  Tris Tris-hydroxymethylaminomethan  

  Vmax Maximalgeschwindigkeit  

  XOD Xanthin-Oxidase  

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Inhalt

1  Einleitung  7

1.1  Allgemeines  7

1.2  Kardialer Adenosin und Adenin-Nukleotid Stoffwechsel  8

1.3  Enzyme im Adenosin und Adenin-Nukleotid Stoffwechsel  10

1.3.1  AMP-Desaminase (EC 3 5 4 6)  11

1.3.1.1  Enzymkinetik  12

1.3.1.2  Effektoren der AMP-Desaminase  12

1.3.1.3  Regulation der AMP-Desaminase Aktivität  13

1.3.2  5 Nukleotidase (EC 3 1 3 5)  15

1.3.3  Adenosin-Desaminase (EC 3 5 4 4)  15

1.3.4  Purin-Nukleosid Phosphorylase (EC 2 4 2 1)  16

1.3.5  Xanthin-Oxidase (EC 1 3 2 3)  16

1.3.6  Hypoxanthin-Guanin Phosphoribosyltransferase (EC 2 4 2 8)  17

1.4  Inhibition der am Purin-Stoffwechsel beteiligten Enzyme  17

1.5  Fragestellung  18

2  Material und Methoden  19

2.1  Modelle  19

2.1.1  Isolierte Perfusion nach Langendorff  19

2.1.1.1  Präparation  19

2.1.1.2  Versuchsanlage  19

2.1.1.3  Generelle Versuchsdurchführung  21

2.1.2  Enzymaktivität im Gewebehomogenat  21

2.1.3  Isolierte Kardiomyozyten  22

2.2  Inhibitoren  23

2.2.1  Inhibition der Adenosin-Desaminase durch EHNA  23

2.2.2  Inhibition der Xanthin-Oxidase durch Allopurinol  23

2.2.3  Inhibition der AMP-Desaminase durch GP 3521 und GP 3449  24

2.2.4  Inhibition der Adenosin-Desaminase und AMP-Desaminase durch  

  Coformycin  24

2.2.5  Methotrexat  25

2.3  Protokolle und Fragestellungen  25

2.3.1  Abschätzung der Umsatzrate der AMP-Desaminase unter verschiedenen  

  Bedingungen  25

2.3.1.1  EHNA und Allopurinol  25

2.3.1.2  GP 3521  26

2.3.1.3  Effekte von GP 3521 unter hypoxischen Bedingungen  27

2.3.1.4  Purinfreisetzung unter GP 3449 und EHNA  28

2.3.1.5  Abschätzung der Umsatzrate der AMP-Desaminase unter Coformycin  29

2.3.2  Einfluss der Purin-de novo-Synthese  30

2.3.3  Hemmbarkeit der AMP-Desaminase im myokardialen Gewebeextrakt  30

2.3.4  Myokardialer Nukleotid und Nukleosidgehalt nach Ischämie  31

2.3.5  Zellpermeabilität von Kardiomyozyten  31

2.4  Analytische Methoden  32

2.4.1  Probenaufbereitung  32

2.4.1.1  Probenaufbereitung für die HPLC zur Bestimmung von Adenosin Inosin  

  Hypoxanthin Xanthin und Harnsäure  32

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2.4.1.2  Gewebeextraktion  33

2.4.1.3  Probenaufbereitung der Kardiomyozyten  34

2.4.2  HPLC-Analyse  34

2.4.2.1  Bestimmung der Purine  34

2.4.2.2  Bestimmung der Nukleotide  35

2.4.2.3  Bestimmung von GP 3521 in isolierten Kardiomyozyten  36

2.5  Auswertung und Statistik  36

3  Ergebnisse  37

3.1  Inosin und Hypoxanthin-Freisetzung in Normoxie und Hypoxie zur Bestimmung  

  der Umsatzrate der AMP-Desaminase  38

3.2  Bedeutung der Purin-de novo-Synthese  42

3.3  Direkte Inhibition der AMP-Desaminase zur Bestimmung der Umsatzrate  44

3.3.1  Effizienz der Inhibitoren  44

3.3.1.1  AMP-Desaminase Kinetik unter Coformycin  44

3.3.1.2  Hemmung der isolierten AMP-Desaminase durch GP 3521  45

3.3.2  Effekte von Coformycin und GP 3521 auf die Purinfreisetzung  47

3.3.2.1  Purinfreisetzung in Normoxie unter Coformycin  47

3.3.2.2  Purinfreisetzung unter GP 3521  50

3.3.2.3  Purinfreisetzung in Hypoxie unter GP 3521 und EHNA  53

3.3.3  Wirkung von GP 3521 in globaler Ischämie  55

3.3.4  GP 3521 Permeabilität  56

3.3.5  Purinfreisetzung unter GP 3449  57

3.3.6  Wirkung von GP 3449 bei globaler Ischämie  59

4  Diskussion  61

4.1  Bedeutung der myokardialen AMP-Desaminase  61

4.2  Direkte Inhibition der AMP-Desaminase zur Bestimmung der Umsatzrate  66

4.3  Abschließende Betrachtung  69

5  Literaturverzeichnis  71

6  Zusammenfassung  85

7  Danksagung  89

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1 Einleitung

1.1 Allgemeines

1963 stellten Berne und Gerlach et al. unabhängig voneinander die Adenosin-Hypothese auf, die besagt, dass Adenosin die Koronardurchblutung der kardialen Stoffwechselsituation anpasst (3;26). Bei abfallender kardiomyozytärer Sauerstoffspannung - so die Hypothesewird Adenosin freigesetzt und gelangt durch das Interstitium an die Adenosin-Rezeptoren der glatten Muskulatur der Koronargefäße, um dort eine Vasodilatation zu bewirken. Die dadurch gesteigerte Koronardurchblutung führt zu einer Wiederherstellung der normalen Sauerstoffspannung.

Es konnte in mehreren Studien der koronardilatatorische Effekt von Adenosin gezeigt werden (31;57;62). Heute wissen wir, dass eine Vasodilatation über A 2 -Rezeptoren der glatten Muskelzellen vermittelt wird. Es gibt allerdings auch Hinweise, dass der vasodilatatorische Effekt von Adenosin auch über A 2 -Rezeptoren des Endothels vermittelt wird (57). Stepp und Mitarbeiter untersuchten die Dosis-Wirkungs-Beziehung von interstitiellem Adenosin zur Koronardurchblutung und stellten fest, dass bereits eine Erhöhung der interstitiellen Adenosin-Konzentration um 62 % zu einer halbmaximalen Erhöhung der Koronardurchblutung führte. Dabei wurde kein Hinweis für eine sekundäre Aktivierung eines möglichen Vasodilatators durch endotheliale Adenosin-Rezeptoren gefunden (75). Allerdings scheint Adenosin unter physiologischen Bedingungen keine Rolle bei der koronaren Flussregulation zu spielen. So führte ein um das 4-fache gesteigerter Sauerstoffverbrauch bei Hunden unter körperlicher Belastung zwar zu einem Anstieg der interstitiellen Adenosin-Konzentration, aber nicht in den Maßen, dass eine koronarvasodilatatorische Wirkung herbeigeführt werden könnte (84). Bei belastungsinduzierter O 2 -Mangelversorgung fällt der ATP-Gehalt kaum ab und die Adenosin-Konzentration steigt stark an, während es bei Okklusion und ATP-Katabolismus rasch zu einem ATP-Abfall und erheblichen Zunahmen von Adenosin kommt. Die Adenosin-Freisetzung scheint also nicht vom myokardialen Sauerstoffumsatz abhängig zu sein (49). Auch bei Inhibition der NO-Synthese kommt es nicht zu einer kompensatorischen koronaren Vasodilatation durch Adenosin. Die unter physiologischen Bedingungen gebildeten NO-Mengen haben nur eine moderate koronarvasodilatatorische Wirkung (83).

Adenosin zeigt eine antiadrenerge Wirkung am oxygenierten Herzen (21). Dieser Effekt wird über inhibitorische A 1 -Rezeptor-Subtypen vermittelt. Dadurch wird der

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Phosphorylierungsstatus regulatorischer Proteine beeinflusst (58). Neuere Studien zeigen eine verstärkende Wirkung von A 2a -Rezeptoren auf die von A 1 -Rezeptoren-vermittelten antiadrenergen Effekte (59). Adenosin spielt weiterhin bei der Präkonditionierung des Myokards eine Rolle. Präkonditionierung im Sinne der ischämischen Präkonditionierung bedeutet, dass eine reversible Schädigung des Myokards durch kurze ischämische Phasen zu einer Ausbildung einer Kardioprotektion bei einer späteren irreversiblen Schädigung, also einem Myokardinfarkt führt. Bei Kaninchen wird bei gleichzeitiger Infusion eines Adenosin-Antagonisten und eines α 1 -Antagonisten der präkonditionierende Effekt aufgehoben (13).

1.2 Kardialer Adenosin- und Adenin-Nukleotid-Stoffwechsel

Unter physiologischen Bedingungen stehen mitochondriale ATP-Bildung und der zytosolische ATP-Verbrauch im Gleichgewicht. Substrate werden unter Sauerstoffverbrauch oxidiert, um die notwendige Energie für die Synthese von ATP aus ADP und Pi bereitzustellen. Bei der hydrolytischen Spaltung von ATP zu ADP und anorganischem Phosphat wird dann wiederum Energie frei, die fast alle energieabhängigen zellulären Prozesse treibt. Unter physiologischen Bedingungen werden die Konzentrationen von ATP (6-8 mM), Pi (1-2 mM), ADP (40 µM), AMP (200 nM) und Adenosin (ca. 50 nM) in etwa konstant gehalten. Übersteigt der Verbrauch das Angebot, oder kommt es bei einer plötzlichen Ischämie zu einem rapiden katabolen Abbau der energiereichen Phosphate, dann nimmt die ATP-Konzentration ab, und es kommt zu einem raschen und dramatischen Anstieg von ADP, AMP, Adenosin und weiteren Metaboliten des Purin-Stoffwechsels (15).

In Kardiomyozyten wurden für den weiteren Abbau zu den Purinen und deren Katabolite zwei Wege beschrieben: Zum einen der Abbau von AMP über die AMP-spezifische 5´-Nukleotidase (EC 3.1.3.5, cN-I) zu Adenosin (Adenosin-Weg) und zum anderen der Abbauweg über die AMP-Desaminase (EC 3.5.4.6) zu IMP und nachfolgend über die IMPspezifische 5´-Nukleotidase (cN-II) zu Inosin (IMP-Weg) (Abb. 1.1).

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Abb. 1.1: Adenosin- und Adenin-Nukleotid-Stoffwechsel und beteiligte Enzyme. ADA: Adenosin-Desaminase, AMPDA: AMP-Desaminase, AK: Adenosin-Kinase, 5´NT: 5´-Nukleotidase, XOD: Xanthin-Oxidase, HGPRT: Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase

Die Nukleoside Adenosin und Inosin werden über membranständige Transportsysteme der Kardiomyozyten in das Interstitium freigesetzt. Von dort diffundieren sie in die myokardialen Kapillaren, um dann in die koronarvenösen Gefäße abtransportiert zu werden. In den Endothelzellen werden die Nukleoside auch zu ihren Kataboliten Hypoxanthin, Xanthin und Harnsäure (Urat) abgebaut. Da die Endothelzellen auch eine hohe Adenosin-Desaminase-Aktivität aufweisen, wird auch hier ein Teil des (extrazellulär von Kardiomyozyten gebildeten) Adenosin zu Inosin abgebaut. Die Katabolite gelangen dann ebenfalls in das koronarvenöse System (71).

Unter normoxischen Bedingungen ist die AMP-Hydrolyse der Hauptstoffwechselweg für die Produktion des kardialen Adenosins. Daneben spielt die SAH-Hydrolase (47) und die zytosolische 5´-Nukleotidase (9;33) eine geringe Bedeutung bei der Bildung von Adenosin.

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Mehr als 90% des kardial produzierten Adenosins werden über die Adenosin-Kinase zu AMP rephosphoryliert (sogenannter Adenosine Salvage) (47).

Die globale kardiale Adenosin-Bildungsrate beträgt z.B. im Meerschweinchenherzen etwa 2.3 nmol · min ^-1 · g ^-1 , dabei werden etwa 8% des Adenosins extrazellulär gebildet. Unter physiologischen Bedingungen wird weniger Adenosin koronarvenös freigesetzt als extrazellulär gebildet, und dementsprechend liegt ein Konzentrationsgradient in Richtung Zytosol vor. Das Endothel trägt 5% zum global gebildeten Adenosin bei. Deussen et al. postulieren, dass dennoch die vaskuläre Adenosin-Konzentration über einen großen Bereich vom Endothel reguliert wird (19;20).

Sinkt das myokardiale O 2 -Angebot, so wurde ein gleichzeitiger Anstieg der Adenosin-Freisetzung und des freien AMP beobachtet (35). Dies ist bedingt durch die eingeschränkte und unterbrochene oxidative Phosphorylierung, die bei fortbestehendem ATP-Abbau einen Anstieg der ADP- und AMP-Konzentration zwangsläufig zur Folge hat. Dabei ist die Konzentration von AMP, dem unmittelbaren Vorläufer des Adenosins, von entscheidender Bedeutung für den Umsatz sowohl der AMP-Desaminase als auch der AMP-spezifischen 5´-Nukleotidase. Bisher wurde angenommen, dass die 5´-Nukleotidase in Hypoxie aktiviert wird und es zu einer vermehrten Adenosin-Bildung kommt (29;33). Die Aktivität der 5´-Nukleotidase wird wahrscheinlich durch ADP und vor allem durch Mg ²⁺ reguliert (14;53;72).

In unserem Labor konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass bei moderater Hypoxie (40% O 2 ) das freie AMP und die Adenosin-Bildung um das 4-fache, die koronarvenöse Adenosin-Freisetzung hingegen um das 15-20-fache anstieg. Weitere Versuche zeigten eine Hemmung der Adenosin-Kinase in Hypoxie, deren Ausmaß mit Hilfe eines mathematischen Modells abgeschätzt werden konnte. Vermehrte Adenosin-Bildung bei reduzierter Rephosphorylierung führte dann zu einer deutlich gesteigerten Adenosin-Freisetzung. Da die Metabolisierung von AMP zu Adenosin einem hohen Umsatz unterliegt, führen bereits kleine Änderungen des freien AMP rasch zu einer verstärkten Freisetzung von Adenosin (18).

1.3 Enzyme im Adenosin- und Adenin-Nukleotid-Stoffwechsel

Im Adenosin- und Adenin-Nukleotid-Stoffwechsel haben die nachfolgenden Enzyme eine Bedeutung:

AMP-Desaminase (EC 3.5.4.6): AMP → IMP

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AMP-spezifische 5´-Nukleotidase (EC 3.1.3.5): AMP → Adenosin SAH-Hydrolase (EC 3.3.1.1): S-Adenosyl-L-Homocystein → Adenosin Adenosin-Desaminase (EC 3.5.4.4): Adenosin → Inosin Adenosin-Kinase (EC 2.7.1.2): Adenosin → AMP Purin-Nukleosid-Phosphorylase (EC 2.4.2.1): Inosin → Hypoxanthin Xanthin-Oxidase (EC 1.3.2.3): Hypoxanthin → Xanthin → Urat Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.8): Hypoxanthin → IMP

1.3.1 AMP-Desaminase (EC 3.5.4.6)

Die AMP-Desaminase spielt eine zentrale Rolle bei der Umwandlung von Adenosin-Nukleotiden zu Inosin und Guanin-Nukleotiden, bei der Stabilisierung des Adenylat-Energiehaushalts und bei Reaktionen des Purin-Nukleotid-Kreislaufs. Sie katalysiert die irreversible hydrolytische Desaminierung von 5´-AMP zu eqimolaren Anteilen von 5`-IMP und Ammoniak (88).

Die AMP-Desaminase ist durch eine Multigenfamilie bei Nagern und Mensch charakterisiert. Im menschlichen Gewebe konnten vier Isoenzyme der AMP-Desaminase isoliert werden. Die Benennung richtet sich nach den Geweben, aus denen sie ursprünglich isoliert wurden: M (Muskel), L (Leber), E1 und E2 (Erythrozyten) (61). Mit Ausnahme der E-Isoformen bestehen nur schwache oder gar keine Kreuzreaktivitäten zwischen den AMPD-Isoenzymen. Das Isoenzym E2 konnte zwar mittels Chromatographie und Elektrophorese vom Isoenzym E1 getrennt werden, es konnte jedoch später gezeigt werden, dass 3 Isoformen auf das AMPD3-Gen, dass die Erythrozyten-AMP-Desaminase kodiert, durch alternatives Spleißen zurückzuführen sind (52). In der Skelettmuskulatur verschiedener Spezies konnten immunologisch drei verschiedene Isoenzyme isoliert werden (23). Es sind bei Ratten drei verschiedene Isoenzyme (A, B, C) der AMP-Desaminase bekannt. Diese wurden in Muskulatur (A), Leber, Niere (B) und Herz (C) gefunden und zeichnen sich durch unterschiedliche kinetische, physikalische und immunologische Eigenschaften aus (60). Die Proteinprodukte des AMPD1- und AMPD2-Gens von Ratte und Mensch zeigen eine Kreuzreaktivität. Das AMPD1-Gen produziert Transkripte, die für die Ratten-Isoform A und die humane Isoform M kodieren, das AMPD2-Gen produziert Transkripte, die die Ratten-Isoform B und die humane Isoform M kodieren (56). Die cDNA für das AMP-Desaminase Gen der Herzisoform bei Mäusen ähnelt in der kodierenden Region der Erythrozytenisoform des humanen AMP-Desaminase-Gens und ist bei Mäusen auf Chromosom 7 lokalisiert (87).

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Beim Menschen geht ein Mangel an muskulärer AMP-Desaminase mit Muskelschwäche und Krämpfen einher. So beschrieben Fishbein et al. 1978 in fünf Fällen ein isoliertes vererbbares AMPD-Mangel-Syndrom (22). Bei Herzinsuffizienz wurde eine Assoziation zwischen der Existenz einer AMPD1-Mutation und einer erhöhten Wahrscheinlichkeit eines Überlebens ohne Herztransplantation festgestellt, wobei der Mechanismus unbekannt ist, der hier offenbar zu einer Kardioprotektion führt (50).

1.3.1.1 Enzymkinetik

Die Enzymkinetik der AMP-Desaminase wurde bereits eingehend bei verschiedenen Spezies untersucht. Das pH-Optimum für die AMP-Desaminase von Rattenherzen liegt bei pH=6.8, die Molekularmasse beträgt 81 kDa. Strukturell gesehen ist die AMP-Desaminase ein Tetramer. In Gegenwart von 100 mM KCl zeigt das Enzym eine sigmoidale Substrat-Sättigungskurve. Die Michaelis-Konstante liegt bei K M =5.8 mM (AMP) und die Maximalgeschwindigkeit beträgt Vmax = 11.1 µmol · min ^-1 · mg protein ^-1 (81).

Vergleichende Studien der Kinetik der kardialen AMP-Desaminase von Ratte und Mensch zeigen, dass die Maximalgeschwindigkeit (Vmax) bei Ratten etwa doppelt so hoch und die Michaelis-Konstante (K M ) bei Menschen etwa 2.5-fach höher ist (79). In einer anderen Studie wurde die Aktivität der kardialen AMP-Desaminase bei der Ratte 9-fach höher als die der AMP-Desaminase beim Menschen angegeben (46).

1.3.1.2 Effektoren der AMP-Desaminase

In bisherigen Studien wurden in vitro mögliche Effektoren der AMP-Desaminase untersucht, die die Aktivität des Enzyms modulieren könnten. Ob diese Effektoren tatsächlich in vivo eine Rolle spielen, oder ob die Umsatzrate der AMP-Desaminase durch andere Mechanismen reguliert wird, wurde bisher nicht abschließend geklärt.

Thakkar et al. untersuchten an gereinigter AMP-Desaminase von Kaninchenherzen die Protein-Kinase-C-vermittelte Phosphorylierung. Unter diesen Bedingungen zeigten sie, dass eine Phosphorylierung der AMP-Desaminase zu einer deutlichen Reduzierung des K M -Werts von 5.6 mM auf 1.2 mM ohne Einfluss auf Vmax führte. Sie zogen daraus den Schluss, dass die Umsatzrate der AMP-Desaminase von einem Phosphorylierungs-Dephosphorylierungsmechanismus abhängig sein muss (82). Unter phosphatfreien Bedingungen beim Kaninchenherzen zeigt die AMP-Desaminase eine irreversible

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Konvertierung in ein Pseudoisoenzym mit anderen kinetischen, regulatorischen und stabilisierenden Eigenschaften. Die Michaelis-Konstante ist dabei überraschenderweise um das 10-fache kleiner (K M =0.54 mM AMP) als mit Phosphat, die maximale Aktivität beträgt Vmax=1.4 µmol · min ^-1 · mg protein ^-1 (80).

Hu et al. zeigten ebenfalls, dass in adulten Rattenkardiomyozyten die Aktivität der AMP-Desaminase durch Protein Kinase C erhöht wird. Der gleiche Effekt wurde auch durch alphaadrenerge Stimulation und cAMP hervorgerufen (38). Die gleiche Arbeitsgruppe postulierte, dass intrazelluläres Adenosin durch einen unbekannten Mechanismus die IMP-Produktion von adulten, isolierten Rattenmyozyten um das 2-fache erhöht, wobei ein direkter Effekt von Adenosin auf die AMP-Desaminase, eine über Adenosin-Rezeptoren vermittelte Modulation und ein Einfluss des Transmethylierungsweges ausgeschlossen wurden (39).

Die AMP-Desaminase von Kaninchenherzen wird durch ATP und ADP allosterisch aktiviert. Der K M -Wert sinkt dann auf 1.7 mM. Das Enzym wird durch GTP, Coformycin, Coformycin5´-Phosphat, Palmitoyl-CoA, inorganische Phosphatverbindungen und dem Metall-Chelator o-Phenantrolin inhibiert. Es wurde keine Inhibition durch IMP oder Nikotinamid-Nukleotiden festgestellt (81).

1.3.1.3 Regulation der AMP-Desaminase-Aktivität

Auch wenn bisher kein umfassendes Modell der Regulation der AMP-Desaminase entwickelt wurde, so gibt es doch zahlreiche Einzelbefunde: Auf zellulärer Ebene wurden verschiedene Modelle verwendet, um den Einfluss von oxidativem Stress auf die molekularen, kinetischen und regulatorischen Eigenschaften der AMP-Desaminase zu untersuchen. So wurde ein Oxidationssystem bei der kardialen AMP-Desaminase von Kaninchen verwendet. Wenn die AMP-Desaminase oxidativem Stress ausgesetzt wird, sinkt die Enzymaktivität innerhalb von 5 Minuten um das 7-fache, nach 15 Minuten kommt es zu einer irreversiblen Inaktivierung. Durch den oxidativen Stress kommt es zu keiner Veränderung der molekularen Masse, tetrameren Struktur, des K M -Wertes, der Immunreaktivität und trypsinolytischer Muster. Die Autoren vermuten, dass es zu einer Konversion der Thiol-Bindungsstellen in einen stabilen höher oxidativen Zustand kommt, da die AMP-Desaminase sensibel auf die S-Thiolierung und Thiol-Alkylierung reagiert (41).

Ein anderes Modell untersuchte die Aktivität der AMP-Desaminase adulter Rattenkardiomyozyten, indem eine rasche ATP-Depletion herbeigeführt wird (rapid deenergization). Die Befunde lassen den Schluss zu, dass die AMP-Desaminase durch

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Produkte der anaeroben Glykolyse reguliert wird. Die IMP-Produktion in Zellen, deren Zellatmung vor der ATP-Depletion nicht inhibiert worden war, lag 4-fach höher als in Zellen, deren ATP-Gehalt erhalten blieb, aber einer anaeroben Glykolyse unterlagen. Weiterhin führte eine alpha-adrenerge Stimulation, wie in anderen Studien auch, zu einer Stimulation der AMP-Desaminase (37).

Die gleiche Arbeitsgruppe zeigte in dem gleichen Modell an Kardiomyozyten von neugeborenen Schweinen, dass die Aktivität der AMP-Desaminase vom hormonellen und metabolischen Status der Zellen vor der ATP-Depletion abhängt. Die Vorbehandlung der Zellen mit Adenosin führt zu einem höheren Umsatz von AMP zu IMP. Dies könnte laut Autoren bei der Präkonditionierung eine Rolle spielen. Weiterhin konnte in dieser Studie eine gesteigerte IMP-Produktion durch den Protein-Kinase-C-Inhibitor Staurosporin zu 90% inhibiert werden, der beta-adrenerge Agonist Isoproterenol stimulierte die AMP-Desaminase und der cAMP-Spiegel korrelierte mit der IMP-Bildung (36).

Bei retrograd perfundierten, isolierten Kaninchenherzen führte eine Mangelperfusion zu einer Abnahme der AMP-Hydrolyse. Dies wurde auf eine geringere Aktivität der zytosolischen 5´-Nukleotidase zurückgeführt, die auch nicht durch eine zusätzliche hypoxische Minderperfusion reaktiviert wurde. Im venösen Effluat wurden 30% weniger Purine als erwartet gefunden. Daraus schlossen die Autoren, dass die AMP-Hydrolyse zu Adenosin bei früher Ischämie führend ist, in einer zweiten Ischämiephase kommt es dann zu einer Inhibition der AMP-Hydrolyse, anscheinend – so die Interpretation – durch die Akkumulation von IMP (28).

In einem Rattenherz-Modell mit 2-Deoxy-D-Glucose-Perfusion mit einem niedrigen Gehalt an Pi wurde eine hohe Freisetzung von Inosin und eine niedrige Freisetzung von Adenosin festgestellt. Der Beitrag des IMP-Abbauweges liegt bei 97%. Im Gegensatz dazu steht das anoxische Modell, das sich durch einen hohen Gehalt an Pi auszeichnet. Hier werden gleich hohe Anteile von Adenosin und Inosin gefunden. Der IMP-Abbauweg hat dabei einen Anteil von 23% und der Adenosin-Abbauweg einen Anteil von 77%. Daraus wurde gefolgert, dass Pi die AMP-Desaminase im anoxischen Herzen inhibiert (11;12). Die genannten Studien lassen aber offen, welchen Beitrag die AMP-Desaminase zum AMP-Stoffwechsel in vivo leistet, und welche Bedeutung sie bei moderater Einschränkung des O 2 -Angebotes hat.

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1.3.2 5´-Nukleotidase (EC 3.1.3.5) Im Myokard von Säugetieren existieren zwei unterschiedliche 5´-Nukleotidase-Systeme, von denen eine Isoform membranständig (ekto) und die andere löslich zytosolisch aktiv ist (53). Es konnten in einer Studie bei verschiedenen Spezies (Ventrikelmyokard vom Menschen, Kaninchen, Meerschweinchen, Tauben, Ratten und Schildkröten) erhebliche Unterschiede in den Aktivitäten sowie Verteilungen der 5´-Nukleotidase festgestellt werden (55).

Die globale kardiale Adenosin-Bildungsrate liegt, wie bereits oben erwähnt, in Meerschweinchenherzen bei 2.3 nmol ⋅ min ^-1 ⋅ g ^-1 , davon werden etwa 8% des Adenosins extrazellulär durch die 5´-Nukleotidase gebildet und 70% werden in die zellulären Regionen aufgenommen. Neuere Studien unseres Labors konnten an intakten Meerschweinchenherzen mittels ³¹ P-NMR-Messung zeigen, dass die Umsatzrate der 5´-Nukleotidase über die freie zytosolische AMP-Konzentration reguliert wird (18). Frühere Studien anderer Gruppen interpretierten den massiven Anstieg der Purinnukleosidfreisetzung in Hypoxie oder Ischämie dahingehend, dass die Aktivität der 5´-Nukleotidase durch diese Stoffwechselsituationen reguliert wird (30;34). Es konnte jedoch in unserem Labor gezeigt werden, dass eine Hemmung der Adenosin-Kinase durch Hypoxie letztlich zu einem Anstieg der Purinfreisetzung führt (18). Desweiteren gilt Magnesium als ein allosterischer Effektor der 5´-Nukleotidase und verstärkt die Adenosin-Bildung. In Inhibitorstudien am isoliert perfundierten Meerschweinchenherzen wurde gezeigt, dass die durch Magnesium aktivierte Purinfreisetzung hauptsächlich über die Ekto-5´-Nukleotidase katalysiert wird (53). Durch Inhibition der 5´-Nukleotidase mit alpha,beta-Methylen-Adenosin-5'-diphosphat (AOPCP, 50 µM) wurde die Purinnukleosidfreisetzung im venösen Effluat in Ischämie um 41% gesenkt (25). Dagegen konnte in unserem Labor mit Inhibition der 5´-Nukleotidase durch AOPCP ein etwa 10-facher Anstieg der Adenosin-Nukleotide unter basalen Bedingungen gesehen werden, während die Adenosin-Freisetzung unverändert blieb. In Hypoxie kam es zu einem 3-fachen Anstieg der Adeninnuklotidfreisetzung, aber zu einem 40-fachen Anstieg der Adenosin-Freisetzung (9).

1.3.3 Adenosin-Desaminase (EC 3.5.4.4)

Adenosin wird durch die Adenosin-Desaminase zu Inosin desaminiert. Decking und Mitarbeiter konnten zeigen, dass die Blockade der Adenosin-Desaminase am Meerschweinchenherzen durch EHNA zu einem 2.5-fachen Anstieg der Adenosin-Freisetzung in Normoxie führte. In Hypoxie wurde ein 3-facher Anstieg der Adenosin-

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Freisetzung beobachtet. Anhand eines mathematischen Modells wurde abgeschätzt, dass etwa 15% des gebildeten Adenosins (0.3 – 0.5 nmol ⋅ min ^-1 ⋅ g ^-1 ) durch die Adenosin-Desaminase zu Inosin metabolisiert wird (18). Die Enzymaktivität liegt im Homogenat von Meerschweinchenherzen bei 2.7 µmol ⋅ min ^-1 ⋅ g ^-1 .

1.3.4 Purin-Nukleosid-Phosphorylase (EC 2.4.2.1)

Die Purin-Nukleosid-Phosphorylase baut Inosin zu Hypoxanthin ab. Histochemische Untersuchungen haben eine hauptsächlich endotheliale Aktivität der Purin-Nukleosid-Phosphorylase gezeigt (8). Durch die Blockade des Enzyms mit 8-Aminoguanosin in Kardiomyozytenkulturen wird der Anteil von Inosin, der in die Nukleotide eingebaut wird, deutlich reduziert (90). Inosin wird also nach Ansicht der Autoren erst nach dem Abbau zu Hypoxanthin in IMP eingebaut.

1.3.5 Xanthin-Oxidase (EC 1.3.2.3)

Die Xanthin-Oxidase - ein Eisensulfat-Molybdän-Flavoprotein - vermittelt unter Oxidation die Metabolisierung von Hypoxanthin zu Xanthin und von Xanthin zu Harnsäure. Bei diesem Vorgang entstehen auch Superoxidradikale. Das Enzym wurde durch immunhistochemische Untersuchungen ausschließlich im Endothel von Kapillaren nachgewiesen (42). Bei einem autosomal-rezessiv vererbten Defekt der Xanthin-Oxidase sinken beim Menschen die Harnsäurespiegel, während die Xanthin- und Hypoxanthinwerte im Blut und Harn ansteigen. Dadurch kann es zur Ausbildung von Xanthinnierensteinen kommen.

Das Endothel im mikrovaskulären Gefäßbett ist der Hauptort für die Entstehung von Harnsäure, da sich hier die Xanthin-Oxidase finden lässt. Das makrovaskuläre Endothel enthält hingegen keine Xanthin-Oxidase, so dass die Purine hier lediglich bis zu Hypoxanthin abgebaut werden. Das Enzym spielt eine bedeutende Rolle bei der Bildung von Sauerstoffradikalen nach der postischämischen Reperfusion im Myokard. Sauerstoffradikale tragen zur kontraktilen Dysfunktion nach Ischämie bei (27).

Diese Annahme konnte durch Inhibition der Xanthin-Oxidase bestätigt werden, da es bei Inhibition nach globaler Ischämie zu einer deutlichen Verbesserung der myokardialen Kontraktilität kam (32).

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1.3.6 Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.8) Die Purin-Basen Hypoxanthin und Guanin werden durch die HGPRT zu GMP oder IMP unter Freisetzung von Pyrophosphat wiederverwertet. Bei einem Defekt oder bei völliger Inaktivität des X-chromosomal kodierten Enzyms kommt es zu einer massiven Purinsynthese-Steigerung. Der Grund liegt imWegfall der allosterischen Hemmwirkung von IMP und GMP auf die Glutamin-PRPP-Amidotransferase, dem Schlüsselenzym der Purin-Biosynthese. Dieses als Lesch-Nyhan-Syndrom bekannte Krankheitsbild führt zu schweren zentralnervösen Störungen, Hyperurikämie und Nierensteinleiden.

In Kulturen schlagender Kardiomyozyten wurde eine hohe Aktivität der HGPRT beobachtet, wodurch der Anteil des Hypoxanthin, der zu IMP wiederverwertet wird, denjenigen Anteil der zu Xanthin und Harnsäure abgebaut wird, sogar übersteigt (90). Dieser Befund widerspricht allerdings einer früheren Studie der gleichen Arbeitsgruppe, bei der eine langsame Wiederverwertung von Hypoxanthin zu IMP beobachtet wurde (91).

1.4 Inhibition der am Purin-Stoffwechsel beteiligten Enzyme

Wie bereits zuvor in Kap. 1.2, Abb. 1.1 dargestellt, wird AMP einerseits über die AMP-Desaminase zu IMP und anschließend über die IMP-spezifische Isoform der 5´-Nukleotidase (cN-II) zu Inosin metabolisiert. Andererseits wird AMP über die AMP-spezifische 5´-Nukleotidase (cN-I) zu Adenosin und daraufhin über die Adenosin-Desaminase ebenfalls zu Inosin abgebaut. Die Bedeutung dieser beiden Metabolisierungswege kann durch die effektive Blockade der beteiligten Enzyme bestimmt werden. Bei Blockade der ADA wird Inosin nicht mehr aus Adenosin, sondern ausschließlich aus IMP gebildet. Zwar hat die Blockade der ADA einen Anstieg der Adenosin-Konzentration, und damit sowohl der Adenosin-Freisetzung als auch der Adenosin-Rephosphorylierung zur Folge. Aber angesichts der hohen Umsatzrate der Myokinase-Reaktion dürfte die AMP-Konzentration nur wenig verändert werden, und die Umsatzrate der AMP-Desaminase ebenfalls. Die Freisetzungsrate von Inosin ist somit direkt von der Umsatzrate der AMP-Desaminase abhängig. Inosin wird im Regelfall weiter zu Hypoxanthin, Xanthin und Harnsäure abgebaut, wobei Xanthin aber auch aus Guanin gebildet werden kann. Blockiert man nun den Umsatz von Hypoxanthin und Xanthin, also die Xanthin-Oxidase, so sollte die Freisetzung von Inosin und Hypoxanthin ausschließlich von dem Abbau von IMP zu Inosin abhängen, und somit ein quantitativ verlässliches Maß für die Umsatzrate der AMP-Desaminase sein. Um die Umsatzrate der AMP-Desaminase über die koronarvenöse Inosin- und Hypoxanthin-Freisetzung bestimmen

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