Synthese und Strukturaufklärung von Sekundärmetaboliten aus Schleimpilzen und lipophilen Hefen

Synthese und Strukturaufklärung
von Sekundärmetaboliten aus
Schleimpilzen und lipophilen Hefen
Dissertation von
Gregor Wille
Ludwig-Maximilians-Universität
München
2000

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Ludwig-Maximilians-Universität München

vorgelegt von
Gregor Wille
aus Berlin
2000

München, am 10. Dezember 1999
Dissertation eingereicht am 14.12.1999
1. Gutachter Prof. Dr. Wolfgang Steglich
2. Gutachter Prof. Dr. Paul Knochel
Mündliche Prüfung 21.01.2000

Inhaltsverzeichnis I
Zusammenfassung ... 1
Einleitung
1 Naturstoffchemie - woher, wohin, wozu ? ... 3

2 Stellung und Bedeutung von Pilzen in der Natur ... 4
    2.1 Standortbestimmung: Pilze zwischen Pflanzen und Tieren ... 4
    2.2 Unterteilung innerhalb der Pilze in einzelne Klassen ... 5
    2.3 Myxomyceten (echte Schleimpilze) ... 6

Teil A: Naturstoffe aus Myxomyceten
3 Bisindolylmaleinimide - Inhaltsstoffe aus Schleimpilzen ... 8
    3.1 Allgemeine Übersicht ... 8
    3.2 Biochemische Vernetzung der Bisindolylmaleinimide untereinander ... 10
    3.3 Biomimetische Synthesen von Maleinimiden ausgehend von Lycogalsäure ... 13
    3.4 Ganz besondere Stoffe: Staurosporin, Rebeccamycin und K-252a ... 14
    3.5 Totalsynthetische Bearbeitung der Materie ... 16
        3.5.1 Zugänge zu Arcyriarubin und Arcyriaflavin ... 16
        3.5.2 Totalsynthese von Arcyroxocin A und N-Methylarcyriacyanin ... 20

4 Naturstoffe mit Bisindolylstruktur ohne Maleinimid ... 22
    4.1 Indolocarbazole - Herkunft und Nachweis im Organismus ... 22
        4.1.1 Funktion des Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptors (AHR) ... 23
        4.1.2 Interaktion von Indolocarbazolen und anderen Substraten mit dem AHR ... 25
    4.2 Allgemeines zu Violacein und Desoxyviolacein ... 26

5 Untersuchungen zu Bisindolylmaleinimiden aus Schleimpilzen ... 30
    5.1 Themenstellung ... 30
    5.2 Bearbeitete Strukturen ... 30
        5.2.1 Synthesen zu Arcyroxocin A und B ... 30
        5.2.2 1-Hydroxyarcyroxocin ... 34
        5.2.3 Arcyroxindol ... 36
        5.2.4 Staurosporinon ... 44
            5.2.4.1 Syntheseversuche zu Staurosporinon ... 45
        5.2.5 Violacein und Desoxyviolacein ... 48
            5.2.5.1 Synthese von N-Benzyldesoxyviolacein ... 48
            5.2.5.2 Synthese von Violacein und Desoxyviolacein ... 50
    5.4 Einordnung der Ergebnisse ... 52

Teil B: Stoffwechsel von lipophilen Hefen
6 Biologische und methodische Grundlagen zu den Hefen ... 53
    6.1 Klassifizierung der Hefen ... 53
    6.2 Nähere Betrachtung der Malassezia-Hefen ... 54
    6.3 Besondere Bedeutung von Hefen für die Medizin (spez. Dermatologie) ... 54
    6.4 Strategien zur Behandlung von Mykosen ... 55

7 Medizinische Grundlagen der Hautkrankheit Pityriasis versicolor ... 56
    7.1 Wie hängen Pityriasis versicolor und Malassezia furfur zusammen ? ... 56
    7.2 Bisherige Deutungsversuche der Erscheinungsformen von Pityriasis versicolor ... 57
    7.3 Das Hautpigment Melanin - Biosynthese und ihre Inhibierung ... 58
    7.4 Themenstellung ... 61

8 Untersuchungen zu Metaboliten aus Malassezia-Hefen ... 62
    8.1 Neuartige Kulturbedingungen ermöglichen einen neuen Forschungsansatz ... 62
    8.2 Nachweis einfacher Indolderivate aus dem Rohextrakt ... 63
    8.3 Strukturaufklärung von Malassezin ... 64
    8.4 Synthetischer Zugang zu Malassezin ... 70
        8.4.1 Syntheseplanung ... 70
        8.4.2 Synthese von Malassezin ... 71
    8.5 Evaluierung der biologischen Aktivität von synthetischem Malassezin ... 76
        8.5.1 Untersuchung der inhibitorischen Wirkung von Malassezin auf Tyrosinase ... 76
        8.5.2 Untersuchung der inhibitorischen Wirkung von Malassezin auf Tyrosinkinasen ... 77
        8.5.3 Wechselwirkung von Malassezin mit dem AHR ... 78
    8.6 Untersuchung von weiteren Metaboliten aus Malassezia furfur ... 80
    8.7 Einordnung der Ergebnisse und Ausblick ... 83

Experimenteller Teil
9 Verwendete Geräte, Chromatographie und allgemeine Arbeitsmethoden ... 85
10 Synthesevorschriften für Arcyroxocin B ... 88
11 Synthesevorschriften zu Arcyroxindol ... 97
12 Synthesevorschriften für Violacein und Desoxyviolacein ... 103
13 Isolierung von Naturstoffen aus Malassezia furfur ... 113
14 Synthesevorschriften für Malassezin ... 115

Anhang
15 NMR- und HPLC-Spektren ... 126
16 Daten zu den Röntgenstrukturanalysen ... 128
Abkürzungen ... 142
Literatur ... 144

Zusammenfassung
· Der Naturstoff Arcyroxocin B (11, aus Myxomyceten) wurde in 15 Stufen, ausgehend von Indol (39), 4-(_-Tetrahydropyranyloxy)indol (68) und 3,4-Dibrom-1-methylmaleinimid (40) mit 4 % Gesamtausbeute hergestellt. Im Rahmen von Reaktivitätsuntersuchungen gelang die Struktursicherung der Oxocin-Grundkörper von Arcyroxocin A und B (10 und 11) durch Röntgenstrukturanalyse. Ferner wurden Versuche zur biomimetischen Synthese von 1-Hydroxyarcyroxocin A (12) aus 10 unternommen.

! Abbildung fehlt in der Vorschau !
· Syntheseversuche zum Naturstoff Arcyroxindol (17) ergaben zwar nicht das Zielmolekül, lieferten jedoch interessante Zwischenergebnisse. So wurde die stereochemische Orientierung einer 1,3-dipolaren Cycloaddition an N-Benzylmaleinimid durch Röntgenstrukturanalyse eindeutig bestimmt. Der Baustein (E)-137 wurde als thermodynamisch günstigeres Produkt gegenüber dem (Z)-Isomer durch Wittig-Reaktion erhalten.

! Abbildung fehlt in der Vorschau !
· Die Darstellung der blauen Bakterienpigmente Violacein (94) und Desoxyviolacein (95) gelang ausgehend von Indol (39) bzw. 5-Benzyloxyindol (163), Isatin (105) und Pyrrol (146) in fünf bzw. vier Stufen. Im Schlüsselschritt der Synthese wurde das Rohprodukt einer Aldolreaktion an Kieselgel erhitzt. Dabei erfolgte simultan die Olefinierung, die Oxidation des Lactams und die Abspaltung der Boc-Schutzgruppen.

! Abbildung fehlt in der Vorschau !
· In Zusammenarbeit mit der Hautklinik Gießen wurde der Naturstoff Malassezin 177 aus Kulturen des lipophilen Hefepilzes Malassezia furfur isoliert und in seiner Struktur aufgeklärt. Ferner wurde eine fünfstufige Synthese für 177 mit 19 % Gesamtausbeute erarbeitet. GC/MS-Untersuchungen und eine leichte Transformierbarkeit von 177 zu Indolo[3,2- b]carbazol (80) weisen auf die Bildung dieser Substanzklasse durch den Hefepilz hin, über dessen Stoffwechsel bislang wenig bekannt ist.

! Abbildung fehlt in der Vorschau !
Die Synthese von 177 basiert auf Indol (39) und Indol-3-carbaldehyd (173), die als einfache Indolderivate zuvor ebenfalls im Rohextrakt von M. furfur-Kulturen nachgewiesen wurden. Die Induktion einer erhöhten Produktion von Cytochrom P450 durch Bindung an den Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor (AHR) von 80 ist bekannt. Malassezin (177) konnte als erster Naturstoff identifiziert werden, der mit einer nicht planaren Vorzugskonformation als Agonist am AHR wirkt.

Einleitung
1 Naturstoffchemie - woher, wohin, wozu ?
Ähnlich der Artenvielfalt in Flora und Fauna hat die Natur auch auf molekularar Ebene eine unübersehbare Vielzahl von Verbindungen hervorgebracht. Besonders "artenreich" ist dabei die Klasse der Sekundärmetabolite im nichttierischen Bereich. Diese Substanzen sind zwar für die Lebensfunktionen des Organismus nicht essentiell, haben jedoch vielfach bemerkenswerte Eigenschaften. So verleihen etwa Farbstoffe den Blumen ihre ästhetische Schönheit, schützen sich Schierlingspflanzen durch Alkaloide vor Fraß oder verschaffen sich Schimmelpilze durch ihre Antibiotika Wachstumsvorteile gegenüber Bakterien. Auch Sekundärmetabolite ohne erkennbare Funktion haben sich für den Menschen als nützlich erwiesen, der diese Schatzkammer für seine Gesundheit und zur Verbesserung seiner Lebensqualität nutzt. Schon vor ca. 4.500 Jahren verwendeten die Ägypter den Indigo zur Blaufärbung von Textilien, den sie aus dem Schmetterlingsblütler Indigofera tinctoria gewannen.[1] Dies geschah freilich noch ohne Verständnis der chemischen Vorgänge beim Herstellen des Pigments über mehrere Schritte. Ebenso gebrauchten die Spanier seit 1513 die peruanische Chinarinde zur Schmerz- und Fieberbekämpfung, ohne das Chinin als wirksame Substanz erkannt zu haben.[2] Die natürlichen Farbstoffe waren die ersten Syntheseziele der organischen Chemie am Ende des 19. Jahrhunderts (Baeyer patentierte 1880 die erste Indigosynthese). Die Motivation dieser Forschung war nicht zuletzt eine erfolgreiche Vermarktung des Farbstoffs.[3] Im Gegensatz dazu diente die Darstellung des Chinins 1945 durch Woodward et al.[4] vor allem der endgültigen Klärung seiner ungleich komplexeren Struktur.[5] Bekannte Naturstoffe als Syntheseziele sind nach wie vor die Prüfsteine, an denen sich eine neue Methode beweisen muß. Aber erst die Kenntnis der Struktur eines biologischen Wirkstoffs eröffnet die Möglichkeit, dessen Wirkmechanismus zu erkennen und durch (partial-) synthetische Präparate zu optimieren (Bsp. Penicillin).[6,7] Durch die Verbesserung des Screenings wurde es möglich, auch geringste Mengen (< 1 mg) in kurzer Zeit auf ihre biologische Aktivität zu prüfen.[8] Daraus erwächst für die präparative Chemie die Aufgabe der zielgerichteten Synthese von größeren Substanzmengen für weiterführende Tests und der Entwicklung wirksamerer Derivate. So sind nach Seebach[9] die Ziele der organischen (Naturstoff-) Synthese nicht mehr die Moleküle "um ihrer selbst willen, sondern es sind [die] Funktionen und Eigenschaften des hergestellten Gebildes". Dies ist der Hintergrund der vorliegenden Arbeit, welche sich mit der Strukturaufklärung und Synthese von Naturstoffen aus Schleimpilzen und Hautpilzen beschäftigt.