Einfluss von Ethanol auf die Aufnahme von Cyanidin-3-O-ß-D-Glucosid (Weininhaltstoff) am isoliert perfundierten Rattendünndarm

Table of Contents

1  EINLEITUNG  2

1.1  Einordnung der Anthocyane  2

1.2  Vorkommen und tägliche Aufnahme von Flavonoiden  3

1.3  Strukturen  3

1.4  Wirkung  4

1.5  Absorption und Metabolismus von Flavonoiden/ Anthocyanen/ Cyanidin 3 O ? D-Glucosid  6

1.6  Zielsetzung  7

2  MATERIAL  8

2.1  Versuchstiere und Haltungsfutter  8

2.2  Arzneimittel und Geräte für die Perfusionen  8

2.3  Chemikalien  10

2.4  Geräte  12

3  METHODEN  14

3.1  Die Dünndarmperfusion  14

3.1.1  Einführung und Technik  14

3.1.2  Perfusionsmedien  17

3.1.3  Apparativer Aufbau des Perfusionsmodells  18

3.1.4  Versuchsdurchführung  20

3.2  Analytische Methoden  22

3.2.1  Bestimmung der Viabilitätsparameter  22

3.2.2  Bestimmung von Cyandin 3 Glucosid mittels RP-HPLC  23

3.2.3  Enzymatische Umsetzung der Glucuronide und Sulfate  28

3.2.4  Überprüfung der Methode der Glucuronid- und Sulfatspaltung mittels p-Nitrophenol und  

  dessen Konjugate  29

3.3  Aufarbeitung der Proben und Gewebe  33

3.3.1  Aufarbeitung der venösen Perfusionsproben  33

3.3.2 Aufarbeitung der luminalen Perfusionsproben 33

3.3.3 Aufreinigung des perfundierten Darmgewebes 34

3.3.4 Aufreinigung der Mesenterialgefäße 35

3.4 Vorversuche/ Zusatzversuche 35

3.4.1 Stabilität von Cyanidin-3-O-?-D-Glucosid in luminaler Lösung 35

3.4.2 Stabilität von Cyanidin-3-O-?-D-Glucosid gegenüber den Enzymen für die Glucuronid- und Sulfatspaltung bei 37 °C 38

3.4.3 Wiederfindung von Cyanidin-3-O-?-D-Glucosid aus dem Darm 39

3.4.4 Überprüfung der Kontrollperfusionen auf Cyanidin-3-O-?-D-Glucosid-Freiheit 39

3.5 Berechnungen und Statistik 40

3.5.1 Berechnung der Fluxe 40

3.5.2 Berechnung der Substrat-Konzentrationen 41

3.5.3 Statistische Auswertung 41

4 Ergebnisse 42

4.1 Viabilität 42

4.2 Kontrollperfusionen 45

4.3 Cyanidin-3-O-?-D-Glucosid-Perfusionen 46

4.3.1 Darstellung der einzelnen C3G-Perfusionen 46

4.3.2 Darstellung der einzelnen C3G-EtOH-Perfusionen 50

4.4 Gesamtüberblick der Aufnahme an Cyanidin-3-O-?-D-Glucosid in allen Perfusionen 55

4.5 Gesamtüberblick der Wiederfindung an Cyanidin-3-O-?-D-Glucosid in allen Perfusionen 55

4.6 Gesamtaufnahme [%] aller Perfusionen mit Cyanidin-3-O-?-D-Glucosid 56

4.7 Ergebnisüberblick 57

4.8 Histologische Befunde 61

5 Diskussion 63

6 Zusammenfassung 67 Literaturverzeichnis 68 Anhang 75

Tabellen

Tab.1.1: Antioxidative Wirkung von Anthocyanen in Abhängigkeit von der Anzahl der Hydroxylgruppen 4

Tab.3.1: Zusammensetzung der FC-43?- Emulsion 17

Tab.3.2: Zusammensetzung der luminalen Lösung in den Perfusionen 18

Tab.3.3: Zeitpunkte der Probenentnahmen und gemessene Parameter 21

Tab.3.4: Gradient während der HPLC-Analyse 25

Tab.3.5: Ergebnisse der Glucuronidspaltung von p-Nitrophenylglucuronid 31

Tab.3.6: Ergebnisse der Sulfatspaltung von p-Nitrophenylsulfat 31

Tab.3.7: Stabilität von C3G bei Raumtemperatur 36

Tab.3.8: Stabilität bei 37 °C 36

Tab.3.9: Stabilität im Kühlschrank 37

Tab.3.10: Stabilität bei -70 °C 37

Tab.3.11: Stabilität von C3G gegenüber ?-Glucuronidase in luminaler und vaskulärer Lösung 38 Tab.3.12: Stabilität von C3G gegenüber ?-Glucuronidase-Sulfatase in luminaler und vaskulärer Lösung 39

Tab.3.13: Wiederfindung von C3G aus dem Darm 39

Tab.4.1: Sauerstoff-Fluxe aller Perfusionen 43

Tab.4.2: Glucose-Fluxe aller Perfusionen 43

Tab.4.3: Lactat-Fluxe aller Perfusionen 43

Tab.4.4: Lactat-Pyruvat-Quotienten aller Perfusionen 43

Tab.4.5: Mittlere Werte für den Organdruck aller Perfusionen 43

Tab.4.6: Durchschnittliche arterielle pH-Werte aller Perfusionen 43

Tab.4.7: Durchschnittliche venöse pH-Werte aller Perfusionen 44

Tab.4.8: Durchschnittliche Rattengewichte 44

Tab.4.9: Durchschnittliche Darmtrockengewichte 44

Tab.4.10: C3G und Glucuronide im Lumen [nmol;%] in der 1. C3G-Perfusion 46

Tab.4.11: Venöse Aufnahme von C3G [nmol;%] in der 1. C3G-Perfusion 47

Tab.4.12: C3G, Glucuronide und Sulfate im Lumen [nmol;%] in der 2. C3G-Perfusion 47

Tab.4.13: Venöse Aufnahme von C3G, Glucuroniden und Sulfaten [nmol;%] in der 2. C3G-Perfusion 48

Tab.4.14: C3G und Glucuronide im Lumen [nmol;%] in der 3. C3G-Perfusion 49

Tab.4.15: Venöse Aufnahme von C3G und Glucuroniden [nmol;%] in der 3. C3G-Perfusion 49

Tab.4.16: Gesamtaufnahme [nmol] aller drei C3G-Perfusionen 49

Tab.4.17: Gesamtaufnahme [%] aller drei C3G-Perfusionen 50

Tab.4.18: C3G und Glucuronide im Lumen [nmol;%] in der 1. C3G-EtOH-Perfusion 51

Tab.4.19: Venöse Aufnahme von C3G und Glucuroniden [nmol;%] in der 1. C3G-EtOH-Perfusion

51

Tab.4.20: C3G im Lumen [nmol; %] in der 2. C3G-EtOH-Perfusion 52

Tab.4.21: Venöse Aufnahme von C3G und Glucuroniden [nmol;%] in der 2. C3G-EtOH-Perfusion

52

Tab.4.22: C3G im Lumen [nmol; %] in der 3. C3G-EtOH-Perfusion 53

Tab.4.23: Venöse Aufnahme von C3G [nmol; %] in der 3. C3G-EtOH-Perfusion 53

Tab.4.24: Gesamtaufnahme [nmol] aller drei C3G-EtOH-Perfusionen 54

Tab.4.25: Gesamtaufnahme [%] aller drei C3G-EtOH-Perfusionen 54

Tab.4.26: Gesamtaufnahme aller Perfusionen mit C3G in [%], n = 6 56

Tab.4.27: Gehalt an Cy-Konjugaten in Darm und Blutgefäßen 61

Abbildungen

Abb.1.1: C6-C3-C6-Körper der Flavonoide 3

Abb.1.2: Anthocyanidin-Struktur 3 Abb.1.3: Cyanidin 3

Abb.1.4: Cyanidin-3-O-?-D-Glucosid 3

Abb.3.1: Ratte nach erfolgreicher Katheterisierung. Über den blauen Katheter erfolgte die arterielle Versorgung mit Perfusionsmedium, über den grünen der venöse Abfluss. 16

Abb.3.2: O2-Dissoziationskurve von Vollblut mit einem Hämatokrit von 45% und der FC-43®-Emulsion bei 37 °C (modifiziert nach [38]). Der Pfeil markiert die maximale O2-Freisetzung bei einem Abfall des O2-Partialdrucks von 500 auf 50 mm Hg. 17

Abb.3.3: Versuchkammer mit Vorratsgefäss mit Perfusionsmedium, Filmoxygenator, Schlauchpumpe, Manometer, Organbad mit Darm, Perfusor mit Glasspritze 19

Abb.3.4: Dünndarmpräparation im beheizten (37 °C) und feucht gehaltenen Organbad 20

Abb.3.5: HPLC-Anlage mit Pumpe und Eluentenflaschen, Autosampler, Säule, Messzelle, Detektor und Integrator 24

Abb.3.6: Standard mit C3G und Nar 26

Abb.3.7: Standard mit Cy und Nar 26

Abb.3.8: Eichgerade C3G für luminale Proben 27

Abb.3.9: Eichgerade C3G für venöse Proben 27

Abb.3.10: Probe von p-Nitrophenylglucuronid (RT = 4,1) vor und nach der Glucuronidspaltung. Der Glucuronidpeak verschwindet, der Peak des p-Nitrophenols (RT = 10,4) wird deutlich größer. 32 Abb.3.11: Das linke Chromatogramm zeigt einen p-Nitrophenol-Standard, das mittlere eine Probe von p-Nitrophenylsulfat vor der Sulfatspaltung, das rechte danach. 33

Abb.3.12: Stabilität von C3G in luminaler Lösung 38

Abb.4.1: Luminale Probe einer Kontrollperfusion ohne C3G 45

Abb.4.2: Venöse Probe einer Kontrollperfusion ohne C3G (rechter Peak ? Naringin) 45

Abb.4.3: C3G-Menge und Glucuronide in den luminalen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der 1. C3G-Perfusion 47

Abb.4.4: C3G-Menge in den venösen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der

1. C3G-Perfusion 47

Abb.4.5: C3G-Menge, Glucuronide und Sulfate in den luminalen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der 2. C3G-Perfusion 48

Abb.4.6 C3G-Menge, Glucuronid und Sulfate in den venösen Proben im Verhältnis zum lum. Vorlauf in [%] in der 2. C3G-Perfusion 48

Abb.4.7: C3G-Menge und Glucuronide in den luminalen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der 3. C3G-Perfusion 49

Abb.4.8: C3G-Menge und Glucuronide in den venösen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der 3. C3G-Perfusion 49

Abb.4.9: C3G-Menge und Glucuronide in den luminalen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der 1. C3G-EtOH-Perfusion 51

Abb.4.10: C3G-Menge und Glucuronide in den venösen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der 1. C3G-EtOH-Perfusion 51

Abb.4.11: C3G-Menge in den luminalen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der

2. C3G-EtOH-Perfusion 52

Abb.4.12: C3G-Menge und Glucuronide in den venösen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der 2. C3G-EtOH-Perfusion 52

Abb.4.13: C3G-Menge in den luminalen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der

3. C3G-EtOH-Perfusion 53

Abb.4.14: C3G-Menge in den venösen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der

3. C3G-EtOH-Perfusion 53

Abb.4.15: Übersicht der C3G-Aufnahme für alle Perfusionen 55

Abb.4.16: Übersicht der C3G-Wiederfindung für alle Perfusionen 55

Abb.4.17: Venöse Probe einer C3G-Perfusion mit Spuren von Cyanidin (RT = 19,639) 59

Abb.4.18: Darmgewebe nach Umsetzung mit ?-Glucuronidase. Der C3G-Peak (RT ~ 11,9) wird kleiner, Cy (RT ~ 19,6) wird zunehmend gebildet. 60

Abb.4.19: Blutgefässe nach Umsetzung mit ?-Glucuronidase und ?-Glucuronidase-Sulfatase. C3G (RT ~ 11,9) baut sich ab, der Peak des Cy (RT ~ 19,1) wird größer. 61

Abb.4.20: Probe der Blutgefässe nach Zudotieren von Cy. Der Peak (RT = 20,0) wurde deutlich größer. 61

Abb.4.21: Histologischer Schnitt der Darmmucosa, 100fache Vergrößerung. Exemplarisch wird hier deren Unversehrtheit gezeigt. 62

Anhang

Tab.1: Konzentrationen von Glucose, Pyruvat und Lactat der Kontrollperfusionen, n = 4 Tab.2: Konzentrationen von Glucose, Pyruvat und Lactat der C3G-Perfusionen, n = 3 Tab.3: Konzentrationen von Glucose, Pyruvat und Lactat der C3G-EtOH-Perfusionen, n = 3 Tab.4: Viabilitätsparameter der Kontrollperfusionen, n = 4 Tab.5: Viabilitätsparameter der C3G-Perfusionen, n = 3 Tab.6: Viabilitätsparameter der C3G-EtOH-Perfusionen, n = 3 Tab.7: Luminale Flussraten der Kontrollperfusionen Tab.8: Luminale Flussraten der C3G-Perfusionen Tab.9: Venöse Flussraten der Kontrollperfusionen Tab.10: Venöse Flussraten der C3G-Perfusionen Tab.11: Ratten- und Darmtrockengewichte der Kontrollperfusionen Tab.12: Ratten- und Darmtrockengewichte der C3G-Perfusionen

Tab.13: Signifikanzwerte (T-Test), Vergleich der Kontroll-, C3G- und C3G-EtOH-Perfusionen

1 EINLEITUNG

Was macht Blüten und Früchte so farbenfroh? Wer schon einmal mit Anthocyanen gearbeitet hat, kann dies leicht erkennen, (u. a. an seinen Fingern beim Versuch ein Vorratsgläschen von Cyanidin-3-O-ß-D-Glucosid zu öffnen). Anthocyane sind eine Gruppe von chemisch verwandten, wasserlöslichen, blauen, violetten und roten Farbstoffen, die neben anderen Substanzen (Betalaine, Carotinoide) diese charakteristischen Färbungen hervorrufen [8]. Sie sind im Pflanzenreich weit verbreitet. Ihr Name wurde vom griechischen: anthos = Blüte und kyanos = blau abgeleitet [8].

1.1 Einordnung der Anthocyane

Anthocyane zählen zu den Flavonoiden, also den polyphenolischen Verbindungen [44]. Derzeit sind mehr als 8000 dieser polyphenolischen Verbindungen bekannt [6]. Als eine der wichtigsten Untergruppen werden die Flavonoide angesehen [6]. Sie alle fallen unter den Begriff der sekundären Pflanzenstoffe. Das heißt, sie werden im Sekundärstoffwechsel der Pflanze gebildet im Gegensatz zu den primären Pflanzenstoffen wie Kohlenhydrate, Proteine, Fette und Ballaststoffe, welche Produkte des Primärstoffwechsels der Pflanzen sind [44].

Als wichtige der bisher 13 definierten Untergruppen der über 5000 Flavonoide lassen sich neben den Anthocyanen Flavone, Flavonole, Flavanole, Flavanone, Catechine und Isoflavone nennen [6,22,42].

Natürlicherweise liegen Anthocyane als Glykoside vor. In der Regel sind an die Aglykone Monosaccharide gebunden, die sich mit verdünnten Säuren oder enzymatisch abspalten lassen [8]. Die Verwandtschaft von Glykosid und Aglykon drückt sich zumeist auch in ihren Namen aus (z. B. Cyanidin und Cyanidin-3-O-ß-D-Glucosid).

_________________________________________________________________________

Seite 2

1.2 Vorkommen und tägliche Aufnahme von Flavonoiden

Reich an Flavonoiden sind Nahrungsmittel wie z. B. Zwiebeln, Grünkohl, Bohnen, Broccoli, Johannisbeeren, Tee, Weintrauben und Wein [6].

Cyanidin-3-Glycosid ist das am weitesten verbreitete Anthocyan im Pflanzenreich [25] und somit in Feldfrüchten, Bohnen, Früchten, Gemüse und Rotwein zu finden [39]. Für einen italienischen Rotwein ermittelte Ghiselli et al einen C3G-Gehalt von 38 mg/ L [12]. In einem kalifornischen Rotwein wurden z.B. 2,8 mg/ L C3G gefunden [4]. Die Gesamtphenolgehalte von Weißweinen beliefen sich auf 199- 242 mg/ L, für Rotweine lagen die Werte um das zehnfache höher (2057- 2567 mg/ L) [4].

Über die tägliche Aufnahme lässt sich nur schwer eine verlässliche Aussage treffen. Die Literaturwerte variieren stark. Die Angaben reichen von 2,6 mg Flavonoiden pro Tag gemessen in Finnland [17] bis zu 1 g/d, was der von Kühnau in den 70er Jahren aufgestellten Schätzung für die Flavonoid-Aufnahme in den USA entspricht [22]. Allerdings ist man sich heute weitgehend einig, dass letzterer Wert zu hoch gegriffen ist und begründet das, mit den unzureichenden Analysenmethoden zur damaligen Zeit [6]. Des Weiteren findet sich bei Hertog et al ein Wert von 23 mg/d. Als Quellen für die Flavonoide werden hierbei vor allem Tee, Zwiebeln und Äpfel angegeben [16].

1.3 Strukturen

Abb.1.1: C 6 -C 3 -C 6 -Körper Abb.1.2: Anthocyanidin-Struktur der Flavonoide

_________________________________________________________________________

Seite 3

Abb.1.3: Cyanidin Abb.1.4: Cyanidin-3-O-ß-D-Glucosid

1.4 Wirkung

Im Pflanzenreich spielen Flavonoide eine wichtige Rolle für den Schutz der Pflanze z. B. vor Schäden durch UV-Licht [45]. Möglicherweise schützen sie auch die tierische Zelle vor oxidativem Schaden [43].

Bedingt durch ihre Struktur können Flavonoide u nd somit auch Anthocyane Wasserstoffatome aus ihren phenolischen Hydroxyl-Gruppen abgeben und damit radikalische Sauerstoffverbindungen abfangen [4,5].

Freie Sauerstoffradikale verursachen Oxidationen von niedermolekularen Substanzen und von LDL [4].

Anthocyane sind wirkungsvolle Fänger von HO ^• , O 2 ^•- ,ROO ^• und NO ^• [5]. Sie wurden

allerdings lange Zeit nicht als physiologische Antioxidantien angesehen, da sie zwar in Säure stabil sind, aber unter neutralen Bedingungen leicht zerfallen [41]. In wässriger Phase ist die antioxidative Wirkung von der Anzahl und der Stellung der Hydroxylgruppen abhängig.

_________________________________________________________________________

Seite 4

Tab.1.1: Antioxidative Wirkung von Anthocyanen in Abhängigkeit von der Anzahl der Hydroxylgruppen

Eine relativ starke Fähigkeit zum Abfangen freier Radikale ist mit einer OH-Gruppen in 3`- und/ oder 4`- Position verbunden [5].

Anthocyanen werden außerdem entzündungshemmende und antimikrobielle Wirkungen nachgesagt sowie deren Beteiligung an der Verhinderung bzw. Unterdrückung von Thrombozytenaggregation und Tumorwachstum [23,25]. Somit geht man von einem protektiven Einfluß dieser Stoffe auf koronare Herzkrankheiten und Krebs aus [11,31,44]. Natürlich muß an dieser Stelle das „Französische Paradoxon“ erwähnt werden [4]. In epidemiologischen Untersuchungen konnten in Frankreich weniger Herz-Kreislauf-Erkrankungen und dadurch bedingte Todesfälle festgestellt werden als in anderen industrialisierten Ländern Europas und den USA, obwohl die bekannten Risikofaktoren für koronare Herz-Erkrankungen wie erhöhte Serumcholesterinspiegel, hoher Fettverzehr, Hypertonie, hoher Body-Mass-Index oder Rauchen nicht seltener zu finden sind. Diese paradoxe Beobachtung wird auf den vergleichsweise hohen Weinkonsum der Franzosen zurückgeführt. Wein enthält als wirksame Bestandteile Alkohol und phenolische Verbindungen [4]. Dabei ist nicht klar, welche und wie die Stoffe nun möglicherweise wirksam sind [10]. Ist Alkohol im Wein eine definierte, wenn auch in der Quantität schwankende Komponente, so gibt es doch erhebliche qualitative und quantitative Unterschiede bei den enthaltenen Phenolen bedingt durch Rebsorte, geographische Herkunft, Jahrgang und Gewinnung [4].

In vivo führt der Genuss von Rotwein zu einem Anstieg des antioxidativen Potentials im Blutplasma und zum Schutz von LDL- und Plasmalipide vor oxidativer Schädigung [4]. Allerdings ist hierfür der Wirkungsmechanismus der Weinphenole noch unklar. In vitro führt der Entzug von Ethanol zu einer erheblichen Abnahme der antioxidativen Aktivität der Rotweine [4].

_________________________________________________________________________

Seite 5

In Weißweinen finden sich weniger sowie auch andere phenolische Inhaltsstoffe als im Rotwein. Dies führte wiederum in vitro zu einer etwa 8 - bis 18-mal geringeren antioxidativen Wirkung von Weißwein [4]. Im Gegensatz zu den nativen Weinen wurden für entalkoholisierte Weißweine überwiegend kleinere IC 50 - Werte (das ist die Menge Phenol, welche die LDL-Oxidation zu 50% hemmt) gefunden, was für den antioxidativ wirksamerer Phenole im Weißwein spricht [4].

Nicht bewiesen ist ein Einfluss auf die Thrombozytenaggregation durch Weinphenole [4]. Hierfür wird eher der Alkohol verantwortlich gemacht [31]. In Studien, die vornehmlich in den USA durchgeführt wurden, sah man einen ähnlichen Effekt von Bier oder Spirituosen auf das Vorkommen von koronaren Herzkrankheiten wie beim Wein. Dagegen spricht aber, dass in Großbritannien bzw. Irland weit mehr Erkrankungen am Herz-Kreislauf-System zu verzeichnen sind, wobei hier nicht der Alkohol- wohl aber der Weinkonsum geringer ist als beispielsweise in Frankreich [31].

So wird zumeist ein Vorteil von Wein vermutet, außerdem verbunden mit der Annahme eines positiven Effekts, wenn dieser wie oftmals der Fall zum Essen genossen wird [37]. Vermutlich kommt es zu einem günstigen Einfluss auf die postprandiale Hyperlipidämie [9] und zu einer Art Schutz, d. h. Minderung des Effekts der Nahrungsfette auf die Thrombozytenaggregation [31].

1.5 Absorption und Metabolismus von Flavonoiden/ Anthocyanen/

Cyanidin-3-O-ß-D-Glucosid

Was ist in unserer täglichen Nahrung an Flavonoiden enthalten? Wie wirken sie? Wie viel brauchen wir davon? Ist es der Alkohol im Wein, die Phenole oder ein Zusammenspiel beider Komponenten, was uns das französische Paradoxon erklären könnte? Vor allem interessiert uns jedoch, wie die Absorption funktioniert und wie viel von dem, was mit der Nahrung aufgenommen wird, tatsächlich biologisch verfügbar ist.

Bisher ist sehr wenig über die Absorption von Polyphenolen im Gastro-Intestinal-Trakt bekannt [6]. Einfache phenolische Strukturen, Flavonoide und Aglykone beispielsweise werden direkt im Dünndarm durch die Mucosa absorbiert [6]. Es gibt die Ansicht, dass die

_________________________________________________________________________

Seite 6

meisten Glykoside erst in den Dickdarm gelangen und dort durch Bakterien zu den Aglykonen hydrolysiert werden [6]. Dies wurde durch einen Versuch an keimfreien Ratten bestätigt, bei denen die Flavonoidglykoside im Faeces unverändert ausgeschieden wurden [6]. Im Colon würden die Aglykone durch das Darmepithel aufgenommen und/ oder in der Leber an Glucuronsäure oder Sulfat konjugiert und methyliert [6]. Konjugationen sind übliche Reaktionen, um Stoffe zu detoxifizieren, außerdem wird die Löslichkeit erhöht, was wichtig für die Exkretion in der Galle ist [45]. Einige Autoren gehen davon aus, dass Glykoside im Dünndarm unverändert absorbiert werden [18,19,25,40, Paganga]. Einige Glykoside (z.B. die des Quercetins) sowie Hydroxyzimtsäuren wie die Chlorogensäure können möglicherweise über Natrium-abhängige Transportsysteme absorbiert werden [45]. Einige Versuche belegen sogar eine bessere Absorption der Glykoside als der Aglykone [19,25,40]. Nach oraler Gabe von C3G an Ratten (0,9 mmol/ kg KGW) findet sich nach 30 min ein Maximum im Plasma. Cy kann auch nach 4 h nicht detektiert werden. Weiterhin wird nach 60 min eine 8-mal höhere Konzentration an Protocatechusäure (PC) festgestellt, welche eventuell durch den Abbau von Cy entsteht. Nach der Inkubation mit β-Glucuronidase und Sulfatase steigt der Gehalt an C3G, Cy und PC nicht, also wird davon ausgegangen, dass keine Glucuronide und Sulfate gebildet werden [40]. Auch in einer weiteren Studie steigt die Plasmakonzentration von C3G nach oraler Verabreichung. Und das sowohl bei Ratten als auch bei Menschen. Auch hier werden kein Cy wie auch keine Glucuronide und Sulfate gefunden [25].

1.6 Zielsetzung

Am nahezu physiologischen Modell des isoliert perfundierten Rattendünndarms soll die Absorption von C3G, einem phenolischen Weininhaltsstoff, untersucht werden. In einer ersten Versuchsreihe wird C3G in einer wässrigen Lösung luminal verabreicht. Danach wird in einer zweiten Versuchsreihe die Aufnahme von C3G bei Anwesenheit von Ethanol bestimmt.

Es sollen folgende Fragen geklärt werden: ? Wie viel C3G wird aufgenommen? ? Wird diese Aufnahme von Ethanol beeinflusst? ? Welche Metaboliten entstehen?

_________________________________________________________________________

Seite 7

2 MATERIAL

2.1 Versuchstiere und Haltungsfutter

Sprague-Dawley Albinoratten, männlich, Alter am Perfusionstag: 45-50 Tage Charles River Wiga GmbH, Sulzfeld, D

Altromin Kontrolldiät C 1000, sojaarm, enthält Casein, Maisstärke, Saccharose, Zellulose, Sonnenblumenöl; Nährstoffzusammensetzung im Anhang Altromin GmbH & Co KG, Lage, D

2.2 Arzneimittel und Geräte für die Perfusionen

Xylazin 2% (Xylazinhydrochlorid, 20 mg Xylazin)

Medistar Arzneimittelvertrieb GmbH, Holzwickede, D Narketan 10% (Ketaminhydrochlorid, 100 mg Ketamin/mL) Chassot AG, Ravensburg, D Heparin (10 000 I. E./ mL) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, D Isofluran-Baxter

Baxter Deutschland GmbH, Unterschleissheim, D Narkose-Ether Riedel-de-Haën, Seelze, D

Dreiwegehähne Discofix ^® -3

Perfusor Secura

B. Braun Melsungen AG, Melsungen, D Mullbinden Pur-Zellin Paul Hartmann AG, Heidenheim, D Silikonschlauch (2,0 x 4,0) mm Schlauch Laboflex, violett/weiß ID 2,79 mm Mikropumpenschlauch, grün/grün ID 1,86 mm Kronlab Chromatographie und Labortechnik GmbH, Sinsheim, D _________________________________________________________________________

Seite 8

Seide sterilisiert, schwarz 4/0 USP 1,5 metric Tierärztebedarf J. Lehnecke, Schortens, D

Terumo Neolus ^® Kanülen 0,65 x 32 mm (violett), 0,40 x 20 mm (grau)

Surflo Katheter 1,3/G16 x 51 mm grau, 0,95/G18 x 51 mm grün, 0,85/G22 x 32 mm blau Einmalspritzen, Plastipak ^® 1 ml, 5 mL

Operationsbesteck mit Scheren und Pinzetten

EHS Medizintechnik, Stuttgart, D Rollenpumpe Minipuls 2 Gilson, Villiers le bel, F Blutdruckmeßgerät Minimus 2 (Manometer) Rudolf Riester, Jungingen, D Organbad aus Polycarbonat

Werkstatt der Technischen Zentrale der Universität Hohenheim, D pH- und Blutgasanalysator ABL 30 (Acid-Base-Analyzer) Radiometer, Kopenhagen, DK Haake-Thermostat Haake-Meßtechnik GmbH & Co, Karlsruhe, D Carbogen-Gas (95% O 2 + 5% CO 2 ) Sauerstoffwerk Friedrichshafen GmbH, Friedrichshafen, D Versuchskammer mit Ventilator, Thermostat und Thermofühler Pt-100 Firma Kästner, Hohenheim, D Graduierte Reagenzgläser Ganzglasspritze Fortuna ^® , 50 mL

Merck Eurolab, Bruchsal, D

Kontroll-Messkolben mit Skala am Halsteil (50 ± 0,06 mL) Hirschmann EM ^® Techcolor Germany

Kaskadenoxigenator aus Glas

Zinsstag, Stuttgart (Möhringen), D Magnetrührer ICA Combimag RCO

_________________________________________________________________________

Seite 9

2.3 Chemikalien

Alle verwendeten Chemikalien und Lösungsmittel hatten, wenn nicht anders bezeichnet, analytische Reinheit (pro analysi) bzw. HPLC-Reinheit.

Zum Herstellen von Lösungen und Verdünnungen wurde ultrapures Wasser (16-18,2 MΩ) aus der Wasseraufbereitungsanlage verwendet.

Flavonoide/phenolische Säuren und andere phenolische Verbindungen : Cyanidin-3-O-ß-D-Glucosid Chlorid (= Kuromaninchlorid) Cyanidin chlorid Extrasynthèse, Genay, F 4-Nitrophenol 4-Nitrophenyl-β-D-glucuronid 4-Nitrophenylsulfat Naringin (= Naringenin-7-rhamnoglucosid) Fluka, Buchs, CH

weitere Chemikalien:

Helium 99,996 Vol.%

Sauerstoffwerk Friedrichshafen GmbH, Friedrichshafen, D Dexamethason Ethanol, denaturiert für die HPLC Sigma, Steinheim, D L-(+)-Ascorbinsäure >99,5% Essigsäure Rotipuron ^® 100% Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D Acetonitril, LiChrosolv ^® gradient grade >99,9% Methanol, LiChrosolv ^® >99,8% Ameisensäure 98-100% Calciumchlorid-Dihydrat di-Natriumhydrogenphosphat di-Kaliumhydrogenphosphat Kaliumchlorid

_________________________________________________________________________

Seite 10