Inhaltsverzeichnis

1  Einleitung  5

2  Material und Methoden  9

2.1  Schimmelpilze  9

2.2  Nährmedien und Lösungen  10

2.2.1  Bengalrot-Chloramphenicol-Agar (Baggermann, 1979 Anonym, 1983)  11

2.2.2  FP-Agar mit Natamycin (modifiziert nach Rheinbaben et. al, 1981)  11

2.2.3  Hefe-Malzextrakt-Agar (Y-MAgar) (Nickerham, 1951)  11

2.2.4  Kartoffel-Glucose-Agar (PD-Agar) (Fertigagar von Merck)  12

2.2.5  MRS-Agar mit Natamycin (modifiziert nach Man et. al., 1960)  12

2.2.6  Okara-Agar  12

2.2.7  Plate-Count-Agar (PC-Agar) (Fertigagar von Merck)  12

2.2.8  Standard I-Agar (Anonym, 1984)  13

2.2.9  Standard I-Agar mit Natamycin (modifiziert nach Anonym, 1984)  13

2.2.10  Würze-Bouillon (Fertigbouillon von Merck)  13

2.2.11  Verdünnungslösung  13

2.3  Keimzahlbestimmungen  14

2.3.1  Direkte Schimmelpilz-Keimzahlbestimmung mit Thomakammer  

  (modif. n. Rusmin et. al., 1974 Drews, 1976)  14

2.3.2  Indirekte Bestimmung von Lebendkeimzahlen  14

2.4  Geräte  16

2.4.1  Fermentationsschrank für Temperaturen 20 C  16

2.4.2  Fermentationsschrank für Inkubationen bei 15 C  16

2.4.3  Stachelwalze  16

2.4.4  Dampfdruckkochtopf  16

2.4.5  Gefriertrocknung  17

2.4.6  pH-Messung  17

2.4.7  Temperaturmessung  17

2.4.8  Penetrometer  17

2.5  Bakterien-Starterkulturen  20

2.6  Schimmelpilz-Starterkulturen  21

2.6.1  Sporensuspension  21

2.6.2  Versporter Reis  21

2.7  Lagerversuch mit A. elegans-Starterkultur  22

2.8  Okara  22

2.9  Zusätze  23

2.9.1  Milchsäure  23

2.9.2  Glucose  23

2.9.3  Celluclast/Novozym  23

2.9.4  Cellulase  23

2.10  Fermentationen  24

2.10.1  Vorbehandlung der Sojabohnen  24

2.10.2  Vorbehandlung des Okara im Dampftopf  24

2.10.3  Vorbehandlung des Okara im Dampfdruckkochtopf  24

2.10.4  Eigentliche Fermentation  24

2.11  Sensorische Prüfungen  26

2.11.1  Zwischenprüfungen  26

2.11.2  Endprüfung  26

2.12  Literaturrecherche über Ösophagus-Krebs  27

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3  Ergebnisse  28

3.1  Charakterisierung der Schimmelpilze  28

3.1.1  Rhizopus oligosporus  28

3.1.2  Actinomucor elegans  28

3.2  Produktion von R. oligosporus-Starterkultur  30

3.2.1  R. oligosporus-Starterkultur in Erlenmeyerkolben  30

3.2.2  R. oligosporus-Starterkultur in Aluminiumschalen  30

3.3  Produktion von A. elegans-Starterkulturen in Aluminiumschalen  32

3.4  Lagerbarkeit von A. elegans-Starterkulturen  33

3.5  Herstellung von Tempe kedele  36

3.6  Herstellung von Tempe gembus  37

3.6.1  Vorbehandlung des Okara  37

3.6.2  Fermentation zu Tempe gembus  37

3.7  Herstellung von Meidouzha  39

3.7.1  Benötigte Startermenge  39

3.7.2  Fermentationstemperatur und -dauer  40

3.7.3  Fermentationsbehälter  42

3.7.4  Milchsäurezusatz und PH-Verlauf  43

3.7.5  Zusatz von M. varians M 28 und L. curvatus Lc 2  44

3.7.6  Texturveränderung durch Zusatz cellulolytischer Enzyme  46

3.7.7  Lagerung des fertigen Meidouzha  48

3.7.8  Sensorische Endprüfung  48

3.8  Literaturrecherche über Ösophagus-Krebs  50

4  Diskussion  51

5  Zusammenfassung  54

6  Literaturverzeichnis  55

6.1  Übersichten  55

6.2  R. oligosporus und Tempe  56

6.3  A. elegans und Meidouzha  57

6.4  Tofu und Okara  57

6.5  Taxonomie und Methoden  58

6.6  Cellulolytische Enzyme  59

6.7  Ösophagus-Krebs  59

6.8  Sonstiges  59

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"Foods prepared by fermentation, aside from those well known in the West, will increase in amount and use and will spread to other parts of the world, including the Western developed countries…" (Hesseltine, 1981)

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1 Einleitung

Die Herstellung von mit Schimmelpilzen fermentierten Lebensmitteln ist in Ost- und Südostasien weitverbreitet und hat eine lange Tradition. Die unterschiedlichsten Substrate meist pflanzlicher Herkunft werden zu einer reichen Palette von Produkten fermentiert, von denen bisher erst wenige ihren Platz auf dem westlichen Speisezettel gefunden haben (wie zum Beispiel Sojasoße, Miso, Tempe und Reiswein).

Bei den meisten dieser sogenannten Festsubstratfermentationen (solid state fermentation, solid substrate fermentation (Kronenberg et. al., 1975)) werden jeweils feste oder halbfeste, meist vor allem kohlenhydrathaltige Substrate (zum Beispiel Sojabohnen, Pressrückstände aus der Sojamilch- und Pflanzenölgewinnung, Kartoffelschalen) von einem geeigneten Schimmelpilz über- und durchwachsen, so dass die ehemals losen Substratteile durch das Myzel verbunden und verklebt sind und somit einen festen Kuchen bilden, der nach entsprechender Zubereitung für den menschlichen Verzehr geeignet ist (siehe Abbildung 1). Steinkraus (1983) gibt einen guten Überblick über diese Fermentationen. Den nachfolgenden Ausführungen liegt im wesentlichen seine Arbeit zugrunde.

Abbildung 1: Traditionelle asiatische Festsubstratfermentationen (beschränkt auf die in dieser Arbeit erwähnten Produkte)

Das Wort "Tempe" (auch "Tempeh", indonesisch) dient als Oberbegriff für viele Produkte, die mit R. oligosporus fermentiert werden, und erst durch einen Zusatz wird klar, welches spezielle Produkt gemeint ist. Wird "Tempe" alleine gebraucht, steht es für "Tempe kedele", das bei uns bekannteste Beispiel dieser Festsubstratfermentationen.

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Bei der Herstellung von Tempe kedele, die hier stellvertretend für die anderen Produkte kurz geschildert werden soll, werden eingeweichte Sojabohnen mit Rhizopus oligosporus zu festen Blöcken fermentiert, die, zum Beispiel in Scheiben geschnitten und angebraten, ein wohlschmeckendes Hauptgericht oder eine Beilage ergeben. Tempe stammt ursprünglich aus Indonesien und hat heute in Nordamerika bereits einen beachtlichen Bekanntheitsgrad erreicht. Die Gründe dafür sind eine wachsende Verbreitung von asiatischen Restaurants, die Begegnung mit fermentierten Lebensmitteln auf Erholungs- und Geschäftsreisen in den Orient, die Mobilität der asiatischen Zuwanderer und die damit verbundene Verbreitung ihrer (Ess-) Kultur und ein gesteigertes Gesundheitsbewusstsein mit erhöhtem Interesse an natürlichen, kalorienarmen, cholesterinarmen, ballaststoffreichen pflanzlichen Lebensmitteln. Tempe wurde in den USA in die Ernährungsprogramme für warme Schulspeisung und für die Streitkräfte aufgenommen (Harlander et. al., 1986). Verwendet man als Substrat anstatt ganzer Sojabohnen die Rückstände aus der Sojamilchherstellung (Okara), erhält man Tempe gembus. Auf dem indonesischen Markt sind als Starter Blätter von Hibiskus (Hibiscus tiliaceus) und Reiskuchen (Ragi) erhältlich, die mit verschiedenen Stämmen von R. oligosporus und anderen Mikroorganismen bewachsen sind. Von solch einem traditionellen Starter wurde der in dieser Arbeit verwendete Stamm R. oligosporus NRRL 2710 ursprünglich isoliert. Bei der Tempe-Fermentation stellen sich folgende positiven Veränderungen ein: 1. Die Verdaulichkeit der Sojabohnen wird durch den Abbau von Trypsin-Inhibitoren und für den Menschen nicht verwertbaren Zuckern (Raffinose, Stachyose) verbessert, die sonst Flatulenzen verursachen.

2. Die ölhaltige Sojabohne wird durch die Freisetzung von Antioxidantien vor Ranzigkeit geschützt (Györgi et. al., 1964).

3. Die hygienische Sicherheit des Produkts ist dadurch gegeben, dass R. oligosporus ein Antibiotikum produziert, das potentielle bakterielle Toxinbildner am Wachstum hindert (Hang et. al., 1969; Hang et. al., 1972; Ellis et. al., 1974). 4. oligosporus ist kein Mykotoxinbildner, sondern im Gegenteil sogar in der Lage, eventuell vorhandene Mykotoxine abzubauen (Ko, 1982). 5. Tempe liefert durch die Wirkung der in kommerziellen Produkten ebenfalls vorhandenen Bakterien einen vor allem für Vegetarier wertvollen Beitrag zur Vitamin B2-Versorgung (Liem, et. al., 1977).

Ein weiteres Beispiel für die Festsubstratfermentationen ist die Herstellung von Oncom (auch "Ontjom") in Indonesien, bei der meist Presskuchen aus der Ölgewinnung (Erdnuss, Kokosnuss) mit Rhizopus sp. (Oncom hitam) oder Neurospora sp. (Oncom merah) zu schwarzen bzw. orangeroten Kuchen fermentiert werden. Wird Okara als Substrat für Oncom merah verwendet, entsteht Oncom tahu (Saono et. al., 1974).

Der Schimmelpilz Actinomucor elegans wird vor allem in China eingesetzt. Er findet bei der Herstellung von Sufu Verwendung, indem Tofuwürfel (Sojabohnenkäse) von A. elegans überwachsen werden und nachfolgend in einer Lake aus Reiswein reifen (Hang et. al., 1970; Steinkraus, 1983).

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Des weiteren wird in der Literatur beschrieben, dass in manchen Orten Chinas (Huchang, Hankow und Hanyang) durch Fermentation von Okara mit A. elegans sogenanntes "Meitauza" gewonnen wird. Die einzige Originalarbeit von Shih (1937) wurde in zahlreichen nachfolgenden Veröffentlichungen ohne weitere eigene Untersuchungen zitiert. Erst Kronenberg et. al. (1984, 1985) arbeiteten im Labor an

diesem Thema weiter. Es ist deshalb nicht bekannt, wie und wo Meidouzha ( Méi Dòu Zha, sprich Me-i-dou-dscha, chinesisch, "verschimmelter (Soja-) Bohnen-Rückstand", alte Transkription "Meitauza" (Shen, 1986)) heute in China hergestellt wird.

Okara, das Substrat für die Fermentation von Tempe gembus, Oncom tahu und Meidouzha, ist ein in großen Mengen anfallendes Nebenprodukt der in ganz Asien verbreiteten Sojamilch- bzw. Tofu-Herstellung. Eingeweichte Sojabohnen werden zu einem Brei zermahlen, aus dem nach Erhitzung die Sojamilch abgepresst wird, die dann, ähnlich der Käseherstellung, mit geeigneten Fällungsmitteln zu Tofu weiterverarbeitet wird. Der Pressrückstand Okara (japanisch, "ehrenwerte Schale") hat eine krümelige Konsistenz und wird meist als Viehfutter verwertet, obwohl das darin enthaltene Protein (Tab. l) von der Qualität her den anderen Sojabohnen-Fraktionen überlegen ist (Hackler et. al., 1963, 1967). Nur zu einem kleinen Teil wird es für die menschliche Ernährung verwendet, indem es traditionellerweise mit Gemüse gekocht oder zu obenstehenden Produkten fermentiert wird. Aufgrund seiner ernährungsphysiologischen Vorteile ("... there's no nicer way of eating fibre, and it's far too good to give pigs! Byrne, 1984) und seiner preiswerten Verfügbarkeit findet es zunehmend Eingang in die industrielle Lebensmittelproduktion, z. B. als Zusatz in Vollkornbrot oder als Basis für vegetarische Aufstriche und Wurstsurrogate ("soysage", Shurtleff et. al., 1979b).

Tabelle 1: Zusammensetzung von Okara (Shurtleff et. al., 1975) Es war deshalb das Ziel dieser Arbeit, Okara mit einem Schimmelpilz zu einem attraktiven Lebensmittel zu fermentieren, das geeignet ist, den westlichen Speisezettel zu bereichern und das den Wünschen nach einer gesunden protein-und ballaststoffreichen Nahrung entgegenkommt.

Auf der Suche nach einer technologisch sicheren Herstellungsmethode musste zunächst ein Weg gefunden werden, ein technisches Starterpräparat des geeigneten Schimmelpilzes herzustellen, das eine gute Aktivität und ausreichende Lagerfähigkeit besitzt. Dann sollte versucht werden, in Anlehnung an die traditionellen Methoden (Tempe gembus, Meidouzha) die Produktion des Lebensmittels in verschiedenen Fermentationsbehältern zu optimieren. Daneben wurde der Einfluss von bakteriellen Startern aus der Rohwurstproduktion auf die Aromabildung untersucht. Aufgrund des hohen Faserstoffanteils lag es außerdem

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nahe  , die Einsatzmöglichkeiten von technischen cellulolytischen Enzympräparaten  

zu  prüfen.  

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2 Material und Methoden

2.1 Schimmelpilze

Die Stämme folgender Schimmelpilze wurden verwendet: Rhizopus oligosporus NRRL 2710, (= ATCC (American Type Culture Collection) 22959) Actinomucor elegans NRRL 3104.

R. oligosporus befindet sich in der Stammsammlung des Instituts und wurde ursprünglich als Lebendkultur auf Schrägröhrchen von Dr. Berghofer, Nien bezogen. A. elegans wurde mir freundlicherweise vom United States Department of Agriculture (Agricultural Research Service), Northern Regional Research Laboratory (NRRL), Peoria, Illinois (U.S.A.) als Lyophilisat-Pellet, in ein Glasröhrchen eingeschmolzen, zur Verfügung gestellt. Das Pellet wurde in ca. 1 ml sterilem Wasser gelöst, auf einer YM-Platte ausgestrichen, mehrere Tage bei 30°C inkubiert und auf ein YM-Schrägröhrchen überimpft.

Die Stammführung der beiden Schimmelpilze erfolgte alle ein bis zwei Monate durch Überimpfen auf ein neues Schrägröhrchen mit PD-Agar (R. oligosporus) bzw. YM-Agar (A. elegans) und anschließender mehrtägiger Inkubation bei 28-30°C.

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2.2 Nährmedien und Lösungen

Für die Herstellung der Nährmedien und Lösungen wurden die Chemikalien folgender Hersteller verwendet: Gist-Brocades, Delft (NL):

• Delvocid® (50 % Natamycin, 50 % Lactose) Merck, Darmstadt:

• Aceton

• Ammoniumhydrogencitrat C 6 H 14 N 2 O 7

• Kaliumhydrogenphosphat p. A. KH 2 PO 4 *3H 2 O

• Kartoffel-Glucose-Agar Nr. 10130

• Magnesiumsulfat MgSO 4 *7H 2 O

• Mangansulfat MnSO 4 *4H 2 O

• Natriumacetat krist. p.A. CH 3 COONa*3H 2 O

• Natriumchlorid NaCl

• Plate-Count-Agar Nr. 5463

• Würze-Bouillon Nr. 5449 Ohly, Hamburg:

• Hefeextrakt KAT Oxoid Deutschland, Wesel:

• Agar bacteriological (Agar No. 1)

• Hefeextrakt (L 21)

• Lab-Lemco-Powder (L 29)

• Malzextrakt

• Trypton R. Paesel, Frankfurt:

• Chloramphenicol R. Grad B Sigma Chemie, München:

• Bengalrot (Rose bengal, Tetrajodotetrachlorofluoreszein-Natriumsalz) D(+)-

Glucose Furazolidon Tween 80 (Polyoxyethylensorbitanmono-oleat)

Alle Nährmedien und Lösungen wurden 20 min bei 121°C autoklaviert.

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2.2.1 Bengalrot-Chloramphenicol-Agar (Baggermann, 1979; Anonym, 1983)

Trypton 5,0 g

Glucose

Kaliumhydrogenphosphat

Magnesiumsulfat 0,5 g

Bengalrot 0,05 g

Chloramphenicol (in 3 ml Aceton gelöst)

Agar

Aqua deion. ad 1,0 l

pH: 7,2 ± 0,2

2.2.2 FP-Agar mit Natamycin

(modifiziert nach Rheinbaben et. al, 1981)

Trypton 10,0 g

NaCl 5,0 g

Hefeextrakt KAT 5,0 g

Glucose

Delvocid®

Agar

Aqua deion.

Nach dem Autoklavieren und Abkühlen auf 48°C 100 ml Furazolidon-Lösung (0,02 % in Aceton) zugeben und 2-5 min verdampfen lassen.

2.2.3 Hefe-Malzextrakt-Agar (YM-Agar)

(Nickerham, 1951)

Hefeextrakt KAT 3,0 g

Malzextrakt 3,0 g

Trypton 5,0 g

Glucose

Agar

Aqua deion. ad 1,0 l

pH: 6,2 ± 0,2

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2.2.4 Kartoffel-Glucose-Agar (PD-Agar) (Fertigagar von Merck)

Kartoffelinfus 4,0 g

D(+)-Glucose

Agar

Aqua deion. ad 1,0 l

pH: 5,6 ± 0,1

2.2.5 MRS-Agar mit Natamycin (modifiziert nach Man et. al., 1960)

Lab-Lemco

Trypton

Hefeextrakt (Oxoid) 4,0 g

Glucose 20,0 g

Tween 80 1,0 ml

Kaliumhydrogenphosphat 2,5 g

Natriumacetat 5,0 g

Ammoniumcitrat 2,0 g

Magnesiumsulfat 0,2 g

Mangansulfat

Delvocid (R)

Agar

Aqua deion.

2.2.6 Okara-Agar

Okara 200 g

Aqua deion. ad 1,0 l

2.2.7 Plate-Count-Agar (PC-Agar) (Fertigagar von Merck)

Pepton 5,0 g

Hefeextrakt KAT 2,5 g

D(+)-Glucose

Aqua deion.

pH (bei 30°C): 7,0 ± 0,1

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