Aktivierung von Cyclophosphamid in Extrakten aus embryonalen Hühnerlebern

II

Inhaltsverzeichnis

1  Einleitung S  10

1.1  Tierversuche Ersatz- und Ergänzungsmethoden S  10

1.2  Untersuchung von Metabolisierungswegen durch die Nutzung  

  hepatischer Funktionen für in- vitro Verfahren S  11

1.3  Die Entwicklung des Hühnerembryos S  12

1.4  Entwicklung der embryonalen Hühnerleber S  14

1.5  Cytochrom P 450 und die Biotransformation von Fremdstoffen S  15

1.5.1  Cytochrom P 450 S  15

1.5.2  Biotransformation von Fremdstoffen S  15

1.5.3  Biotransformation von Cyclophosphamid S  16

1.5.3.1  Cyclophosphamid S  16

1.5.3.2  Metabolismus von Cyclophosphamid S  17

1.6  Ziel der Arbeit S  17

2  Materialien und Methoden S  19

2.1  Materialien S  19

2.1.1  Cyclophosphamid (Reaktant) S  19

2.1.2  Acrolein (Produkt) S  19

2.1.3  Sonstige Chemikalien S  20

2.1.4  Biologisches Material S  21

2.2  Methoden S  21

2.2.1  Die Herstellung des gebrauchsfertigen Leberextraktes S  21

2.2.1.1  Inkubation der Eier und Entnahme der Lebern S  21

2.2.1.2  Extraktion und Fraktionierung des Lebergewebes S  22

III

2.2.2  Pre-Test: Bestimmung der De-O Ethylase-Aktivität des  

  gewonnenen Leberextraktes mit Ethoxycoumarin S  23

2.2.2.1  Bestimmung von Hydroxy- und Ethoxycoumarin im  

  Fluoreszenzspektrometer S  22

2.2.2.2  Durchführung des Enzymtests mit Ethoxycoumarin S  23

2.2.2.3  Differentielle Extraktion von Ethoxy- und  

  Hydroxycoumarin S  24

2.2.3  Quantitative Bestimmung von Acrolein S  25

2.2.3.1  Herstellung von Stammlösungen S  25

2.2.3.2  Herstellung eines Derivatisierungsreagenzes zur  

  fluorimetrischen Bestimmung von Acrolein S  26

2.2.3.3  Die Derivatisierung von Acrolein zu 7 Hydroxychinolin und  

  Herstellung von Eichkurven S  26

2.2.3.4  Bestimmung von Acrolein mittels Messungen am Fluorimeter S  27

2.2.3.5  Durchführung des Enzymtests zur Aktivierung von  

  Cyclophosphamid S  29

2.2.3.6  Neutralisieren der Enzymansätze S  30

2.2.3.7  Extraktion von 7 Hydroxychinolin aus derivatisierten und  

  neutralisierten Enzymansätzen S  31

2.2.3.8  Bestimmung von Acrolein durch Dünnschichtchromatographie  

  und densitometrische Auswertung der Chromatogramme S  32

2.2.3.9  Proteinbestimmung nach Bradford S  33

3  Ergebnisse S  35

3.1  Aktivitätstest für Cytochrom P 450 mit 7 Ethoxycoumarin S  35

3.1.1  Fluoreszenz von Ethoxy- und Hydroxycoumarin S  35

3.1.2  Quantitative Bestimmung der Aktivität von Cytochrom P 450 mittels  

  Messung der De-O Ethylierung von Ethoxycoumarin zu  

  Hydroxycoumarin S  36

3.2  Kalibrierung der Fluoreszenzsignale von 7 Hydroxychinolin dem  

  Derivatisierungsprodukt aus Acrolein und 3 Aminophenol S  38

IV

3.2.1 Fluoreszenz von 7- Hydroxychinolin im Fluorimeter S. 38

3.2.2 Fluoreszenz von 7- Hydroxychinolin nach Dünnschicht-

chromatographie und Auswertung am Densitometer

3.3 Entwicklung einer Methode zur Isolierung von 7- Hydroxychinolin aus

sauren Ansätzen mittels Neutralisation und anschließender Extraktion S. 41

3.3.1 Neutralisation der Derivatisierungsansätze S. 41

3.3.2 Extraktion von 7- Hydroxychinolin aus sauren und neutralisierten

Derivatisierungsansätzen

3.4 Erfassung von Acrolein in Ansätzen mit Leberextrakt S. 43

3.4.1 Abhängigkeit der nachgewiesenen Acroleinmengen vom Volumen

des eingesetzten Leberextraktes

3.4.2 Erfassung von Acrolein bei konstantem Volumen Leberextrakt im

Enzymansatz

3.4.3 Auswirkung der Inkubationszeit auf die Erfassung von Acrolein S. 47

3.5 Aktivierung von Cyclophosphamid und Nachweis des Aktivierungsproduktes

Acrolein mittels Dünnschichtchromatographie und densitometrischer

Auswertung der Chromatogramme S. 48

3.5.1 Quantitativer Nachweis von Acrolein als Metabolisierungsprodukt von

Cyclophosphamid in Abhängigkeit von der Zeit

4 Diskussion S. 51

5 Zusammenfassung S. 58

6 Literatur S. 60

7 Anhang S. 63

V

Abkürzungsverzeichnis

Aldo- PA Aldophosphamid  

BSA Rinderserumalbumin  

CPA Cyclophosphamid  

CYP 450 Cytochrom P 450  

d Bebrütungstag  

DMSO Dimethylsulfoxid  

DC Dünnschichtchromatographie  

DNA Desoxyribonucleinsäure  

Em. Emission  

Ex. Exzitation  

g Erdbeschleunigung  

Glc-6-P Glukose- 6- Phosphat  

Glc-6-P-DH Glukose- 6- Phosphad- Dehydrogenase  

h Stunde  

HET Hühnereitest  

HPLC High Performance Liquid Chromatography  

4-OH-CPA 4- Hydroxycyclophosphamid  

4-Keto-CPA 4- Ketocyclophosphamid  

M r relative Molekularmasse  

NADP Nikotinamid- Adenosin- Dinucleotid- Phosphad  

R f Relative Wanderungsstrecke  

RFE Relative Fluoreszenzeinheit  

Schmp. Schmelzpunkt  

Sdp. Siedepunkt  

TCA Trichloressigsäure  

TFA Trifluoressigsäure  

Ü 10 Überstand nach Zentrifugation bei 10.000g  

UV Ultravioloett  

VI

Abbildungsverzeichnis

  Abbildung 1: Reaktionsgleichung zur Derivatisierung von Acrolein  27

  Abbildung 2: Fluoreszenz von Hydroxycoumarin  

  (0 5 nmol in 200 µl Probenvolumen bei Ex : 360 nm  

  Em : 465 nm gain40 Mikrotiterplatten: weiß)  35

  Abbildung 3: Fluoreszenz von Ethoxycoumarin  

  (0 15 nmol in 200 µl Probenvolumen bei Exc : 360 nm  

  Em : 465nm gain40 Mikrotiterplatten: weiß)  36

  Abbildung 4: Abhängigkeit der Hydroxycoumarinbildung von  

  der eingesetzten Extraktmenge Ansatzvolumen: 200 µl  37

  Abbildung 5: Vergleich der Fluoreszenz von 7 Hydroxychinolin bei  

  verschiedenen Parametereinstellungen und Emissionsfiltern  39

  Abbildung 6: Densitometrische Bestimmung von Acrolein bei  

  Ex 365 nm Em 420 nm nach  

  dünnschichtchromatographischer Auftrennung  40

  Abbildung 7: Densitometrische Bestimmung bei Ex 365 nm Em 420 nm zum  

  Verbleib von 7 Hydroxychinolin Vergleich der verschiedenen  

  Phasen Extraktionsmittel: Ethylacetat  42

  Abbildung 8: Densitometrische Bestimmung bei Ex 365 nm Em 420 nm zum  

  Verbleib von 7 Hydroxychinolin Vergleich der verschiedenen  

  Phasen Extraktionsmittel: Chloroform  43

  Abbildung 9: Fluoreszenzmessungen zur Abhängigkeit der Menge des  

  gebildeten Acroleins vom Volumen des zugesetzten  

  Leberextraktes bei Ex 360nm Em 465 nm  44

  Abbildung 10: Fluoreszenzmessung zum Nachweis von Acrolein bei Einsatz  

  von 10 µl Leberextrakt Ansatz bei Ex 360 Em 465  46

  Abbildung 11: Nachweis von Acrolein unter Berücksichtigung  

  der Inkubationszeit  47

VII

Abbildung 12: Enzymkinetik: zeitabhängige Bildung von Acrolein 49

Abbildung 13: Fluoreszenzmessungen zur Abhängigkeit der Menge des

gebildeten Acroleins vom Volumen des zugesetzten

Leberextraktes, Einsatz von TCA 64

Abbildung 14: Densitometrische Bestimmung zur Abhängigkeit der

Menge des erfassten Acroleins vom Volumen des

zugesetzten Leberextraktes 64

Abbildung 15: Säulendiagramm zur densitometrischen Bestimmung,

Abhängigkeit der Menge des erfassten Acroleins vom

Volumen des zugesetzten Leberextraktes 65

Abbildung 16 : Densitometrische Bestimmung zur Abhängigkeit der

Menge des gebildeten Acroleins vom Volumen des zugesetzten

Leberextraktes, Einsatz von TCA 65

Abbildung 17: Vergleich der UV- Spektren von 6- und 8- Hydroxychinolin 66

Abbildung 18: Densitometrische Bestimmung zur Bildung von

7- Hydroxychinolin in Abhängigkeit von der Inkubationszeit 67

Abbildung 19: Abhängigkeit zwischen eingesetzter Menge

Acrolein im Ansatz und resultierendem Fluoreszenzsignal

von 7- Hydroxychinolin 68

Abbildung 20: Eichkurve BSA zur Proteinbestimmung im Leberextrakt 69

Abbildung 21: Keimscheibe am animalen Pol, Reorganisation der Keimscheibe

und Bildung von Epi- und Hypoblast [8] 69

Abbildung 22: Bildung der Primitivrinne [8] 70

Abbildung 23: Bildung des Proamnions [11] 70

Abbildung 24: Metabolisierung von Cyclophosphamid 71

VIII

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1:  Reaktionsansatz zur Messung der De-O Ethylase-Aktivität des  23

  Leberextraktes  

Tabelle 2:  Reaktionsansatz zur Messung der De-O Ethylase-Aktivität des  

  Leberextraktes in Abhängigkeit vom eingesetzten  

  Extraktvolumen  24

Tabelle 3:  Stammlösungen und Derivatisierungsreagenz und Angaben zu  

  den Konzentrationen  26

Tabelle 4:  Reaktionsansätze zur Erstellung von Acrolein- Eichkurven  27

Tabelle 5:  Parametereinstellung am Fluorimeter  28

Tabelle 6:  Reaktionsansatz zum Enzymtest: zeitabhängige Metabolisierung  

  von Cyclophosphamid zu Acrolein  29

Tabelle 7:  Parametereinstellungen am Densitometer  33

Tabelle8: Reaktionsansatz  zur Messung der Extinktion bei einer Anregungs  

  wellenlänge von 595 nm im Photometer  34

Tabelle 9:  Vergleich der Enzymaktivitäten in Ansätzen (200 µl) mit 10  15

  und 20 µl Leberextrakt  37

Tabelle 10:  Ermittlung der R f Werte und der Peakflächen (Mittelwert aus  

  Doppelansatz) unterschiedlich konzentrierter Acrolein- Standards  

  Auftragemenge: 5 µl von 500 µl Standard- Ansatz  

  (0 5 15 50 nmol Acrolein derivatisiert)  40

Tabelle 11:  Vergleich der Neutralisation des Ansatzes (1 5M HCl) durch  

  kontinuierliche Zugabe von Natriumhydrogencarbonat  

  Trinatriumcitrat bzw. Natriumacetat (Überprüfung der pH  

  Werte durch pH- Papier)  41

Tabelle 12:  Fluoreszenzmessung am Fluorimeter zur Abhängigkeit der  

  Menge des gebildeten Acroleins von der Menge des  

  eingesetzten Leberextraktes bei Ex 360 Em : 465  45

Tabelle 13:  Bestimmung von Acrolein in Ansätzen mit 10 µl Leberextrakt  46

Tabelle 14:  Vergleich der Menge wieder gefundenen Acroleins bei  

  Inkubationszeiten zwischen 0 und 5 Stunden und  

  Ermittlung der mittleren Acroleinausbeute (in )  48

IX

Tabelle 15: Enzymkinetik: Vergleich der zeitabhängigen Acroleinbildung aus drei Versuchen und Korrektur der Werte unter Berücksichtigung der Ergebnisse aus Kapitel 3.4.3 zur Auswirkung der Inkubationszeit auf die Menge des wieder zu findenden Acroleins 50

Tabelle 16: Bestimmung der konzentrationsabhängigen Fluoreszenzen von Ethoxy- und Hydroxycoumarin bei Ex. 360 nm, Em. 465 nm am Fluorimeter 63

Tabelle 17: Vergleich der Fluoreszenzen derivatisierter Acrolein-Standardreihen bei unterschiedlichen Parametereinstellungen 63

Tabelle 19: Löslichkeit von 6- und 8- Hydroxychinolin in verschiedenen Lösungsmitteln, – nicht löslich, + gut löslich, –/+ teilweise löslich 66

Tabelle 20: Erfassen der Fluoreszenzsignale derivatisierter Acrolein-Standard- Ansätze (0- 50 nmol/ 500 µl Ansatz) und Ermittlung des R f -Wertes für 7- Hydroxychinolin, Auswertung am Densitometer bei Ex. 365 nm und Em. 420 nm nach Dünnschichtchromatographie 68

Tabelle 21: Fluoreszenz von 7- Hydroxychinolin in derivatisierten Standardansätzen mit 50 nmol Acrolein/500 µl Ansatz, Auswertung erfolgte nach DC am Densitometer bei Ex. 365 nm, Em. 420 nm 68

Tabelle 22: Proteinbestimmung;

Messung der Extinktion von BSA- Standardlösungen neben Leberextrakt mit unbekannter Proteinkonzentration bei 595 nm am Photometer 69

10 Einleitung

1 Einleitung

1.1 Tierversuche, Ersatz- und Ergänzungsmethoden

Die Prüfung von Lebensmitteln und deren Inhalts- und Zusatzstoffe sowie die Prüfung von Arzneimitteln, von kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenständen auf ihre gesundheitliche Unbedenklichkeit und Umweltverträglichkeit ist gesetzlich geregelt und erfolgt unter anderem im Tierversuch [1].

Laut Tierschutzgesetz spricht man dann von Tierversuchen, „…wenn zu Versuchszwecken Behandlungen und Eingriffe am Tier bzw. an dessen Erbgut vorgenommen werden, die mit Schmerzen, Leiden oder Schäden für das Tier bzw. für das Erbgut veränderte Tier verbunden sind“ [2].

In der Bundesrepublik Deutschland finden im Vergleich zu den Versuchstierzahlen anderer Verwendungsbereiche im Rahmen der Entwicklung und Prüfung von Arzneimitteln auf Grundlage der Bestimmungen zum Arzneimittelgesetz [3] die meisten Tierversuche statt [4] ¹ . Deshalb spielt der vom Gesetzgeber ausdrücklich geforderte Tierschutz im pharmazeutischen Bereich eine besondere Rolle. Es gilt daher, in diesem Bereich Prüfverfahren zu entwickeln, die einen geringeren oder schonenderen Einsatz von Versuchstieren bedeuten bzw. neben gebräuchlichen in-vivo- Verfahren auch Ersatz und Ergänzungsmethoden auf RRR– (Replacement, Refinement, Reduction) – Grundlagen anwenden[4].

Seit mehr als 100 Jahren wird nun bereits mit dem Hühnerembryo als Basisuntersuchungsmodell gearbeitet [5]. Mit der Entwicklung der HET- Embryotoxizitätsprüfung in den frühen 80- er Jahren wurden diese Grundlagenprüfungen erweitert und standardisiert. Die Prüfungen am bebrüteten Hühnerei (HET) liefern ebenfalls Informationen hinsichtlich der Embryoletalität, Retardierung, Teratogenität und systemischer Toxizität. Darüber hinaus lassen sich mit Hilfe dieser Methode aber auch Erkenntnisse zur Immunpathologie oder zu metabolischen Aspekten, wie sie im Rahmen dieser Arbeit von besonderem Interesse sind, gewinnen.

¹ Ein weiterer großer Teil der Versuche basiert auf den Bestimmungen des Chemikaliengesetztes (ChemG) und des

Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetzes (LmBG) [Prisma]

11 Einleitung

1.2 Untersuchung von Metabolisierungswegen durch die Nutzung

Die oben genannte Testung am bebrüteten Hühnerei stellt laut Lüpke [5] einen Grenzfall zwischen in- vivo und in- vitro dar. Nach allgemeiner Ansicht kollidiert dies nicht mit ethischen und juristischen Aspekten, insbesondere der Tierschutzgesetzgebung.

Da das bebrütete Hühnerei in der Bundesrepublik Deutschland keinerlei tierschutzrechtlichen Restriktionen unterliegt, ist die innerhalb dieser Arbeit stattgefundene Entnahme embryonaler Hühnerlebern mit dem geltenden Gesetz vereinbar [2]. Auch ist laut Tierschutzgesetz §7, Abs. 1 eine „...Organentnahme aus dem zuvor getöteten Tier nicht als Tierversuch zu definieren…“ [4]. Tests mit aufbereiteten Hepatocyten sind zweifelsfrei als in- vitro- Verfahren zu betrachten. Die im Rahmen dieser Arbeit zu testenden Substanzen wurden nicht direkt in den Eikörper injiziert, eine invasorische Behandlung des lebenden Organismus fand also nicht statt. Trotz allem weist die in- vitro- Nutzung des hier verwendeten Prüfmaterials engen Bezug zum Hühnereitest auf, da hier die Leber als Ort der Metabolisierung von zum Beispiel Xeno- oder Endobiotica als ein Baustein innerhalb einer Vielzahl von Prüfsystemen des Hühnerembryos, die im HET untersucht werden, isoliert betrachtet und auf seine Aktivität hin untersucht werden kann.

Die Mikrosomenaufbereitungen des entnommenen Lebergewebes eignen sich für die Prüfung metabolischer Aktivierung, da mithilfe dieses Testmaterials eine große Anzahl von in- vitro-Versuchen ermöglicht wird.

Bei in- vitro Metabolisationstests kann die Bestimmung der verstoffwechselten Substanzen durch direkten laborchemischen Nachweis erfolgen.

Das angebrütete Hühnerei ist in diesem Zusammenhang Gegenstand intensiver Forschungsarbeiten, insbesondere deshalb, weil es bereits sehr früh in seiner Entwicklung eine hohe metabolische Aktivität ausbildet.

Sicher stellt sich auch hier wie in anderen Prüfverfahren die Frage nach der Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den menschlichen Organismus. Denn die meisten in- vitro- Versuchsverfahren stellen nur ein monofaktorielles System dar. Verschiedene physiologische Abläufe innerhalb des in-vivo- Pharmakometabolismus wie der Leber- Nieren- Kreislauf oder der Leber- Darm-Kreislauf bleiben unberücksichtigt [7].

12 Einleitung

Jedoch bietet dieses in- vitro- Verfahren den Vorteil der Flexiblen Gestaltung der Experimente je nach Fragestellung. So zum Beispiel könnten Hepatozyten mit anderen Zelltypen kokultiviert werden, radioaktiv markierte Substanzen können einfach inkubiert und Hepatocyten oder Zellfraktionen für spätere Referenzversuche eingefroren werden. Da eine aufbereitete Leber ein Volumen liefert, welches hohe Versuchszahlen ermöglicht, kann aus diesem Prüfverfahren eine Reduktion von Tierversuchen resultieren.

Ein Verbundverfahren des BMBF ist bereits 1996 angelaufen, um die „...Nutzung hepatischer Funktionen für in-vitro- Verfahren zur Prüfung von Stoffen mit dem Ziel der Einsparung von Tierversuchen...“ zu erforschen [4].

Abschließend ist jedoch darauf hinzuweisen, dass sich in fortgeschrittenen Stadien der Arzneimittelentwicklung mit den angeführten Methoden abschließende Untersuchungen am Ganztier nicht ersetzen lassen.

1.3 Die Entwicklung des Hühnerembryos

Die Embryonalentwicklung aller Wirbeltiere ist ausschließlich in wässriger Umgebung möglich. Für terrestrisch lebende Organismen bedeutet dies die Erfordernis eines flüssigkeitsgefüllten Kompartimentes. Im Verlauf der Evolution entwickelte sich das von einer Schale umhüllte Ei der Reptilien, Vögel und Monotremen. Eine weitere Variante dieser Kompartimentiertung ist der Uterus placentaler Säuger. In Eischale und Uterus befinden sich die Embryonen in einer flüssigkeitsgefüllten Blase, dem Amnion, was zur Bezeichnung dieser Wirbeltierklassen als Amnioten beitrug [8].

Innerhalb der Klasse der Vögel (Aves) bilden die Hühnervögel (Galliformes) eine der insgesamt 28 Ordnungen [9], die wiederum in verschiedene Familien zu unterteilen sind. Die meisten Hühnervögel gehören der beinahe über die ganze Erde verbreiteten Familie der Fasanvögel (Phasianidae) an. Das Haushuhn, zu denen Rassen wie Leghorn, New Hampshire und Cochinchina gehören, stammt von einer weit verbreiteten Kammhuhnart, dem Bankivahuhn (Gallus gallus) ab [10].

Mit der Befruchtung der Oozyte des Huhnes durch das männliche Spermium beginnt die Embryonalentwicklung. Im Ovidukt werden dem sich bereits furchenden Keimling die Eiweißhülle und die kalkhaltige Eischale (sekundären Eihüllen) angelagert.

Zum Zeitpunkt der Eiablage sind die Furchungstadien bereits fast vollständig durchlaufen [11].

13 Einleitung

Infolge meroblastischer Furchung entsteht zunächst eine der Dottermasse diskoidal aufliegende Keimscheibe am animalen Pol [s. Anhang, Abb. 21]. Dieser Entwicklungsschritt vollzieht sich kurz vor der Eiablage. Die Keimscheibe reorganisiert sich durch Zellteilung zum Hypoblast an der Dottergrenze und Epiblast an der Oberfläche. Diese beiden Schichten umschließen ein Blastocoel, die Subgerminalhöhle. Im Bereich des Epiblasten bildet sich durch Emigrationsgastrulation bereits während des ersten Bebrütungstages die Primitivrinne [s. Anhang, Abb.22]. Durch sie wandern Zellen des Epiblasten in den Subgerminalraum und bilden dort entodermale und mesodermale Strukturen. Als Entoderm bezeichnet man die Zellschicht, die durch Einwanderung die Hypoblastzellen verdrängt hat. Das Mesoderm (auch Chordamesoderm) ist eine sich flächig ausbreitende Zellformation in der Subgerminalhöhle. Der Epiblast kann in diesem Stadium nun als Neuroektoderm bezeichnet werden [12].

Im Laufe der Entwicklung falten sich über dem Chordamesoderm die so genannten Neuralfalten auf und bilden im weiteren Verlauf das Neuralrohr, das sich nun komplett vom Epiblasten gelöst hat. Das flächenhafte Aggregat der mesodermalen Zellen differenziert sich zu Chorda, segmentalen Somiten und geschlossenen Seitenplatten [12]. Das über der Dottermasse liegende Entoderm wölbt sich auf und formiert sich zum Rohr des Darmes.

Ekto- und Entoderm breitet sich über die Oberfläche der Dottermasse aus. Das Mesoderm folgt der Umwachsung des Dotters im extraembryonalen Bereich. Eine Vorstufe des Amnions ekto-und entodermalen Ursprungs bildet sich in Form einer sehr zarten Falte (Proamnion) vor dem Kopfgebiet [s.Anhang, Abb. 23].

Schließlich geht dieses seitlich, hinten in das Amnion über und es beginnt eine Amnionfaltung rings um den Embryo (extraembryonale Gewebe). Aus diesem Prozess entsteht eine doppelwandige, mit Flüssigkeit gefüllte, den Embryo schützende Blase, die Amnionhöhle. Die äußere Wand wird als Chorion (Seerosa) bezeichnet. Die Alantois, ein weiteres extraembryonales Organ entsteht aus der Ausstülpung des Enddarmes gegen das Exocoel. Ursprünglich dient es als embryonaler Harnsack, wird jedoch später zum Atmungs- und Resorbtionsorgan. Im Laufe der Entwicklung breitet sich die Allantois über die gesamte Chorionhöhle aus. Zur Ernährung dienen ausschließlich Reservestoffe aus Dotter und Eiweiß. In der Schlussphase der Entwicklung, nach Veröden der Chorion- und Allantoisgefäße, setzt bereits vor dem Schlüpfen die Lungenatmung ein. Der Schlupf findet in der Regel am 19. bis 21. Bebrütungstag statt [12].

14 Einleitung

1.4 Entwicklung der embryonalen Hühnerleber

Die Entwicklung der embryonalen Hühnerlebern ist der Leberentwicklung von Säugerembryonen sehr ähnlich, was eine Übertragbarkeit von Erkenntnissen im Rahmen von Untersuchungen beim Huhn auf den Menschen ermöglicht und beispielsweise für den Bereich der Medizin eine wesentliche Rolle spielt.

Die embryonale Leber setzt sich aus drei Gewebearten zusammen. Zum einen sind dies Zellen entodermalen Ursprungs, die aus einer Ausstülpung des Kopfdarmes herrühren. Des Weiteren findet man das mesenchymale Septum Transversum und Endothelzellen des Primär- sinusoids [14].

Die ersten Leberzellen sind bereits nach dem 2. Bebrütungstag zu erkennen, wenn der Embryo ein 20 bis 23- Somiten- Stadium erreicht hat. Zu diesem Zeitpunkt haben sich bereits Anlagen zu Neuralrohr und Chorda gebildet. Die mesodermalen Säume beidseitig der Chorda sind von Zellblöcken, den Somiten, flankiert [8]. Die primäre Leberanlage ist entodermalen Ursprungs. Nach Entstehen der sekundären Leberzellen bilden sich am vierten und fünften Bebrütungstag ausgehend vom der Darmanlage zwei Seitenäste, so genannte Divertikel. Dies sind die Vorstufen des späteren linken und etwas größeren rechten Leberlappens und der Gallenblase. Zwischen dem 5 und siebten Bebrütungstag beginnt die Sekretion der Gallenflüssigkeit, die aus der rechten und linken Leberhälfte über den paarig angelegten Lebergang (Ductus Hepaticus), der dann in den Ductus Cysticus über geht, eingesammelt wird. Bis zum elften Bebrütungstag erfährt die Leber eine starke Wachstumsphase, in der sie ihr Gewicht von 0,03 mg auf 75 mg vermehrt. [15]. Die Verstoffwechselung von Kohlenhydraten durch die Leber beginnt etwa ab dem sechsten bis siebten Bebrütungstag. In diesem Entwicklungsstadium sind bereits Enzyme und Stoffwechselprodukte des Fett- und Proteinstoffwechsels nachweisbar [16]. Die Bildung Xenobiotika- metabolisierender Enzymsysteme, wie zum Beispiel Cytochrom P 450, tritt etwa ab dem vierten und fünften Tag ein [17].

Im Folgenden wird das angesprochene Cytochrom P 450- Enzymsystem näher betrachtet.

15 Einleitung

1.5 Cytochrom P 450 und die Biotransformation von Fremdstoffen

1.5.1 Cytochrom P 450

Die Cytochrome P 450 (CYP 450) sind eine bedeutende Familie der Hämproteine, die in ihrer reduzierten Form Kohlenmonoxyd binden und dadurch eine charakteristische Absorptionsbande bei 450 nm aufweisen, die für diese Proteinfamilie namensgebend wurde [18, 39]. Die Hauptfunktionen von CYP 450 in der Leber sind die einer O- oder N- Dimethylase oder allgemeiner Dealkylase sowie einer Hydroxylase [19]. Die am weitesten verbreitet Reaktion ist die Monooxidation lipophiler Substanzen [20]. Durch reduktive Spaltung von molekularem Sauerstoff (O 2 ) wird eines der beiden Sauerstoffatome auf den Fremdstoff übertragen, das zweite Sauerstoffatom wird als Wassermolekühl freigesetzt [21]. Deshalb wird CYP 450 auch als mischfunktionelle Oxygenase bezeichnet [22]. Die notwendigen Reduktionsäquivalente werden durch ein FAD- haltiges Hilfsprotein vom Coenzym NADPH+H ⁺ auf die eigentliche Monooxigenase übertragen [23]. In Eukaryoten sind diese Cytochrome vor allem in Membranen des glatten Endoplasmatischen Retikulums lokalisiert. In der Leber der Säuger ist CYP 450 an zahlreichen Entgiftungsreaktionen, vor allem in den so genannten Phase- I- Reaktionen, beteiligt. In Umwandlungsreaktionen werden hier Substanzen oxidativ, reduktiv- oder hydrolytisch verändert. Durch die Hydroxylierung wird die Substanz hydrophiler und kann in der Phase- II-Reaktion mit hydrophilen Stoffen gekoppelt und über die Niere ausgeschieden werden. Besonders gut werden unpolare Verbindungen umgesetzt, die aliphatische oder aromatische Ringe enthalten [23], zum Beispiel Steroidhormone, aber auch Arzneimittel. In bestimmten Fällen werden Arzneistoffe erst durch die Biotransformationsprozesse biologisch aktiv [39]. Aus diesem Grund sind CYP 450- Enzyme für die Pharmakologie von besonderem Interesse. Innerhalb der CYP 450- Familie ist das humane Cytochrom P-450 2B6 (CYP2B6) einer der hauptsächlich beteiligten Enzyme für die Metabolisierung von Cyclophosphamid [24].

1.5.2 Biotransformation von Fremdstoffen

Viele Fremdstoffe, die in den Organismus gelangen, aber auch körpereigene Substanzen haben toxisches Potential, welches es über bestimmte Mechanismen zu beseitigen gilt. Dies geschieht durch Biotransformation, einen Prozess, in dem körpereigene- und fremde Substrate inaktiviert und ausgeschieden werden. Die Biotransformation geschieht vor allem in der Leber und ist, wie bereits angesprochen, durch eine Phase- I- und eine Phase- II- Reaktion gekennzeichnet. In