Untersuchungen zur Wirkung von KP 735 auf das klonogene Wachstum maligner frisch explantierter humaner Tumorzellen in vitro

INHALTSÜBERSICHT

Liste der verwendeten Abkürzungen

1. EINLEITUNG

2. GRUNDLAGEN
2.1. Die Stammzellhypothese
2.2. Entwicklungsgeschichte der Tumorklonierung
2.2.1. Klonierungsverfahren in Petrischalen
2.2.2. Weichagarklonierung in Glaskapillaren
2.2.3. Anwendungsbereiche der Weichagarklonierung und Perspektiven
2.3. Cisplatin
2.3.1. Strukturformel und Wirkungsmechanismus
2.3.2. Wirkungsspektrum, Nebenwirkungen und Pharmakokinetik
2.4. Carboplatin
2.4.1. Chemische Struktur, Wirkmechanismus und Pharmakokinetik
2.4.2. Klinische Wirksamkeit und Nebenwirkungen
2.5. cis-Diammin-[(bis(phosphonatomethyl)amino)acetato(2-)-O1,N1]platin(II)(KP 735)
2.5.1. Chemische Struktur und Physikalisch-chemische Eigenschaften
2.5.2. Herstellung
2.5.3. Untersuchungen zur Interaktion von Platinverbindungen mit Biomolekülen
2.5.4. Hypothesen zum antitumoralen Wirkungsmechanismus
2.5.5. Präklinische Untersuchungen zur Wirksamkeit von KP 735
2.5.6. Toxikologische Daten

3. FRAGESTELLUNG DER DISSERTATION

4. EIGENE UNTERSUCHUNGEN
4.1. Material
4.1.1. Arbeitsgeräte und Labormaterial
4.1.2. Flüssigmaterialien und Medien
4.1.3. Klinisch eingesetzte Zytostatika
4.1.4. Die Platinverbindung KP 735
4.2. Durchführung der Kapillären Weichagarklonierung
4.2.1. Probenentnahme und Transport
4.2.2. Aufarbeitung des Tumormaterials bis zur Einzelzellsuspension
4.2.2.1. Vorgehen bei Punktaten
4.2.2.2. Bearbeitung solider Proben
4.2.2.3. Einfrieren von Tumorzellen und Wiederauftauen
4.2.3. Zellzahlbestimmung und Vitalitätsbeurteilung
4.2.4. Kontinuierliche Exposition
4.2.5. Kurzzeitexposition
4.2.6. Auswertung des klonogenen Wachstums
4.2.6.1. Lichtmikroskopische Zählkriterien
4.2.6.2. Statistische Methoden

5. ERGEBNISSE
5.1. Charakterisierung des untersuchten Tumormaterials
5.1.1. Auswertbare Proben
5.1.1.1. Kontinuierliche Exposition
5.1.1.2. Kurzzeitexposition
5.2. Beeinflussung des klonogenen Wachstums durch KP 735
5.2.1. Antitumorale Aktivität bei Langzeitexposition
5.2.2. Antitumorale Aktivität bei der Kurzzeitexposition
5.3. Antitumorale Wirksamkeit von KP 735 in Abhängigkeit von der Expositionsdauer
5.4. Individuelle Konzentrations-Wirkungskurven
5.5. Wirkungsvergleich zwischen KP 735 und klinisch eingesetzten Zytostatika in vitro
5.5.1. Kontinuierliche Exposition
5.5.2. Kurzzeitexposition
5.6. Tumortypen mit besonderer Sensitivität oder Resistenz gegenüber KP
5.7. Morphologie einzelner Tumorkolonien

6. DISKUSSION

7. ZUSAMMENFASSUNG

8. ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS

9. LITERATURVERZEICHNIS

Liste der verwendeten Abkürzungen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1. EINLEITUNG

In der Bundesrepublik Deutschland stellen solide und hämatopoietische Neoplasien eine der häufigsten Todesursachen dar. Derzeit umfassen die therapeutischen Möglichkeiten die chirurgische Entfernung sowie die Zerstörung des Tumorgewebes durch ionisierende Strahlen oder durch Chemotherapeutika. Da nicht lokalisierbare Tumortypen wie Leukämien oder multiple Metastasen weder auf chirurgischem Weg noch durch Bestrahlung zu erreichen sind, kommt den systemisch verabreichbaren Zytostatika eine besondere Rolle zu. Die meisten der heute eingesetzten Zytostatika wirken, indem sie in biochemische Prozesse wie Nukleotidsynthese, Transkription oder DNS-Replikation eingreifen, d.h. auch proliferierende Zellen des gesunden Gewebes werden geschädigt. Dabei ist die Empfindlichkeit häufig proportional zur Zellteilungsrate. Demzufolge werden zwar vor allem schnell wachsende Tumorzellen geschädigt, jedoch sind auch normale Gewebe wie das Knochenmark, Magen-Darm-Epithel, die Haut und Haarfollikel betroffen. Diese allgemein bekannten Nebenwirkungen sind von Nachteil für den klinischen Einsatz von Chemotherapeutika. Deshalb gilt es, neue Substanzen zu identifizieren, die bei gleicher oder besserer Wirkung weniger Nebenwirkungen mit sich bringen. Von heute jährlich mehr als 10.000 neuen chemischen Verbindungen, die im Rahmen der Krebsforschung auf ihre potentielle antitumorale Aktivität überprüft werden, erreicht nur ein minimaler Bruchteil die Phase der klinischen Untersuchung. Immer noch ist die Chemotherapie der am häufigsten beim Menschen auftretenden Tumoren, wie den Adenokarzinomen des Magen-Darm-Trakts, den nicht-kleinzelligen Lungen-Karzinomen, oft nur marginal wirksam und palliativ. Die hervorragende Wirkung von Cisplatin gegen Hodentumore gibt jedoch den Ansporn, nach neuen anorganischen Substanzen zu suchen, die bestimmte Tumorarten heilen können. Eine Möglichkeit, das Wirkungsspektrum und die antiproliferative Potenz neuer Verbindung zu erforschen, bietet das klonieren von frisch explantierten Neoplasien in vitro im semi-soliden Medium in Verbindung mit der Exposition von verschiedenen Konzentrationsstufen eines Zytostatikums [86]. Auf diese Weise soll im Rahmen der vorliegenden Arbeit die antineoplastische Aktivität von KP 735, einem neuen, Phosphonsäure gekoppelten Derivat von Cisplatin eruiert werden. Dadurch lassen sich auch Hinweise auf die Art und den Umfang des späteren klinischen Einsatzes gewinnen.

2. GRUNDLAGEN

2.1. Die Stammzellhypothese

Untersuchungen an normalen menschlichen Geweben ergaben, daß in der Epidermis, in der gastrointestinalen Mucosa und im Knochenmark nur eine begrenzte Anzahl von Zellen die Fähigkeit besitzt, die Zellpopulation zu erneuern [14], [51], [69], [47]. Diese Erkenntnis führte zur Entwicklung der sog. Stammzellhypothese [51], [69]. Maligne Tumoren stammen ebenso von sich selbst erneuerndem Gewebe ab. Entlang eines hierarchischen Gefälles besitzen die Zellen mit zunehmender Differenzierung eine geringere Fähigkeit zur Zellteilung.

Jede Tumorzelle läßt sich einer von drei qualitativ unterschiedlichen Zellpopulationen zuordnen, die bei Normalgeweben in einer geordneten Reihenfolge ineinander übergehen [47]. Den Ursprung bilden die Stammzellen (stem cells). Nur sie als zahlenmäßig kleiner Teil aller im Tumor bestehender Zellen sind befähigt zur endlosen Vermehrung (self renewal). Stammzellen sind infolgedessen Ausgangszellen für Zellteilungen und Zelldifferenzierungen, welches auch als klonale Expansion bezeichnet wird. Sie sind daher für das Wachstum der Zellpopulation verantwortlich. Die entstehenden Tochterzellen, auch klonogene oder Übergangszellen (transient cells) genannt, verfügen nur noch über eine begrenzte Teilungsfähigkeit. Am Ende dieser Teilungskette steht die vollständig differenzierte Zelle, die kein proliferatives Potential mehr besitzt, die sog. Endzelle (end stage differentiated cell). Nach unterschiedlich langer Zeit stirbt diese schließlich ab. Nach diesem Modell ist der Grad der Differenzierung umgekehrt proportional zu ihrer Proliferationsfähigkeit. Somit spielt die Stammzelle die entscheidende Rolle bei Tumorrezidiven und Metastasen und muß der Hauptangriffspunkt der Therapiebestrebungen sein.

Unter Anerkennung der Stammzellhypothese versuchte man bisher mit den herkömmlichen Klonierungssystemen die "wahren Stammzellen" anzuzüchten [55], [29]. Ein Teil der in vitro koloniebildenden Tumorzellen zeigte jedoch nur eine begrenzte Teilungsfähigkeit und konnte nur über wenige Generationen subkultiviert werden [82], [65], [8]. Für diese Zellen, die ebenso wie die Stammzellen in der Lage sind, Tochterzellen zu bilden, wurde der Begriff "klonogene Zellen" geprägt [12], [13].

Im geeigneten klonogenen Untersuchungsverfahren wie der Weichagarklonierung in Petrischalen oder in Glaskapillaren können Stammzellen sowie klonogene Zellen Kolonien bilden. Die Beziehung beider zueinander ist noch ungeklärt.

2.2. Entwicklungsgeschichte der Tumorklonierung

Im Jahre 1955/56 gelang es Puck et al. ein in vitro-Klonierungsverfahren zu entwickeln. Dabei verwendeten sie die etablierte Zellinie (HeLa) in Monolayerkulturen, deren Einzelzellen im Agar derartige Lebensbedingungen vorfanden, daß aus einigen von ihnen Zellansammlungen, sog. Kolonien bzw. Klone entstanden [71]. In den sechziger Jahren führten Till und McCulloch, Pluznik und Sachs sowie Bradley und Metcalf, sowie Metcalf und Mitarbeiter Kultivierungsversuche mit hämatopoietischen Progenitorzellen (Granulozyten-, Makrophagenvorstufen) durch und brachten damit die Erforschung der normalen und gestörten Hämatopoese einen wichtigen Schritt weiter [83], [12], [58], [68], [59]. Park et al. entwickelten 1971 schließlich ein System, das eine Klonierung von transplantierbaren Myelomen (von Mäusen mit BALB/c-Abstammung) in vitro ermöglichte [63]. Erstmals wurde dabei auch das Verhalten von Myelomlinien gegenüber verschiedenen Zytostatika untersucht [60]. Tumorzellinien stellen ein experimentelles Modell dar, deren Wachstumscharakteristika jedoch von denen solider Tumoren in vivo abweichen können. In vitro-Systeme mit frisch explantiertem Material besitzen einen engeren Bezug zur Klinik und können damit als Bindeglied zwischen Grundlagenforschung und klinischer Forschung dienen. Ogawa et al. simulierten als erste das Verhalten von fortgeschrittenen soliden Tumoren (bei BALB/c-Mäusen) unter Chemotherapie mittels eines klonogenen in-vitro-Untersuchungsverfahrens und sagten die Prognose für ein Ansprechen in vivo richtig voraus [60]. 1967/68 gelang Mc Allister und Mitarbeitern unter anderem die Anzüchtung von in kleine Stücke zerschnittenen menschlichen Tumoren in Weichagar [56], [57]. Doch erst 1977 fanden Hamburger und Salmon bei Experimenten mit humanen Myelomzellen eine Untersuchungsmethode, genannt Human Tumor Cloning Assay (HTCA), die den linearen Zusammenhang zwischen der Anzahl an in Kultur gebrachten Zellen und der Anzahl der daraus gewachsenen Kolonien aufzeigte. Das war die entscheidende Voraussetzung dafür, daß man quantitative Rückschlüsse aus dem Koloniewachstum auf die antitumorale Wirksamkeit von untersuchten Substanzen ziehen kann [22], [28], [30]. Um bei der Auswertung die höchstmögliche Objektivität zu gewährleisten, werden bei der Weichagarklonierung (HTCA) stets zwei Kontrollansätze mitgeführt. Als "Negativkon-trolle", die das Tumorzellwachstum nicht beeinflußt, dient in der Regel das Lösungsmittel der zu untersuchenden Substanz, Aqua ad iniectabilia oder physiologische Kochsalzlösung. Der "Positivkontrolle" wird im allgemeinen eine stark zytotoxische Chemikalie zugesetzt, die alle Zellen zuverlässig abtötet, wie z.B. Abrin, Glutaraldehyd, Colchizin, Natriumazid, Chromomycin A3 oder Vanadiumsalze [35],[32]. Courtenay und Mills entwickelten zur gleichen Zeit ein sehr ähnliches System mit Verwendung von Weichagar als semisolides Medium und verschlossen Teströhren anstelle von Petrischalen. Dieses Verfahren setzte sich jedoch wegen der schwierigen Handhabung nicht durch [17].

2.2.1. Klonierungsverfahren in Petrischalen

Bei der Technik nach Hamburger und Salmon, die von den meisten anderen Forschern, zum Teil in modifizierter Form übernommen wurde, werden bei der Exposition als Behälter für die Zellkulturen Petrischalen mit einem Durchmesser von 35 mm verwendet. Diese erhalten einen zweischichtigen Inhalt. Beim sogenannten "plating" wird auf einen "base-" oder "feeder-layer" mit 0,5 % Bacto-Agar die auf eine standardisierte Zellzahl eingestellte Tumormonozellsuspension in CMRL 1066 als "top-layer" mit 0,3 % Bacto-Agar aufgebracht. Die untere Nährschicht enthält neben 0,2 ml "konditioniertem Medium", das aus adhärenten Milzzellen von BALB/c-Mäusen hergestellt wurde, verschiedene Zusätze wie 5 % Pferdeserum, 10 % FKS sowie Aminosäuren und dient dazu, das Anheften nicht-maligner Zellen, z.B. Fibroblasten, an der Oberfläche der Petrischale zu verhindern. Dies ist insbesondere bei der Bearbeitung frischer Tumorproben von Bedeutung, da solche Zellsuspensionen eine große Anzahl Fibroblasten enthalten, die sich, wenn sie einmal Kontakt zur Plastikoberfläche haben, schneller als die Tumorzellen vermehren und dadurch deren Wachstum behindern und die optische Auswertung erschweren. Später wurde das "konditionierte Medium" durch Mc Coy's 5A-Medium ersetzt. Der "top-layer" enthält neben den Tumorzellen das CMRL 1066, angereichert mit 15 % Pferdeserum, Aminosäuren, Vitamin C, Hormonen bzw. Zytokinen und 0,3 % Bacto-Agar. Auf den Zusatz von Makrophagen-Extrakten, wie ursprünglich von Hamburger und Salmon beschrieben, kann bei den meisten soliden Tumortypen des Menschen verzichtet werden. Die Auswertung der entstandenen Tumorzellkolonien wird nach 21-28 tägiger Exposition mittels eines Phasenkontrastinvertlichtmikroskops (oder eines Bildanalyse-Systems) durchgeführt [32],[28]. Bei Versuchen, die Wachstumsquote zu erhöhen, wurden u.a. anstelle des Agars auch andere Substanzen, wie Agarose und Methylzellulose als Matrix getestet. Agarose bleibt längere Zeit flüssig und ist demzufolge leichter zu handhaben. Methylzellulose wurde in einer 0,8%igen Lösung eingesetzt. Sie ist gut wasserlöslich und erleichtert das Erkennen der Kolonien, kann jedoch aufgrund der Hitzeinstabilität nicht autoklaviert werden, so daß sie mittels UV-Bestrahlung sterilisiert werden muß.

Verglichen mit dem herkömmlichen Agar konnten dabei keine besseren Ergebnisse erzielt werden [32]. Insgesamt ist die Herstellung dieses doppellagigen Agar-Systems in den Petrischalen mit erheblichem technischen Arbeitsaufwand verbunden und außerdem können bei weitem nicht alle untersuchten Tumorproben darin zur Koloniebildung gebracht werden. Ein weiterer Nachteil ist, daß eine relativ hohe Zellzahl eingesät werden muß, um ein ausreichendes Koloniewachstum zu erhalten, so daß bei kleinen Biopsien oft die Gesamtzellzahl nicht ausreicht, um die Sensitivitätstestung mit einer größeren Zahl von Zytostatika durchzuführen. Das Bestehen solcher Einschränkungen für den Einsatz in Klinik und Forschung war der Anlaß, daß in den folgenden Jahren nach weiteren Verbesserungsmöglichkeiten dieser in-vitro-Methode gesucht wurde.

2.2.2. Weichagarklonierung in Glaskapillaren

Bereits 1948 benutzten Sanford und Kollegen erfolgreich Kapillarröhrchen, um in ihnen aus einer Tumoreinzelzelle Zellinien anzuzüchten. Wichtige Grundlage dafür war die Beobachtung, daß eine einzelne Zelle zur Proliferation die Anwesenheit anderer Zellen braucht. Daraus folgerten sie, daß bei Verwendung von Kapillaren aufgrund des kleinen Volumens und damit der geringen Menge Medium eine Einzelzelle eher in der Lage sein würde, sich mit Hilfe der eigenen Stoffwechselaktivität zu akklimatisieren, als wenn sie von anderen Zellen abgegebenen Wachstumsfaktoren abhängig wäre [87]. Abrams ging bei Untersuchungen zur Vermehrung von Knochenmarkszellen auf entsprechende Weise vor [1]. Im Jahr 1981 wurde dieses Verfahren von Maurer und Ali-Osman erstmals bei der Klonierung von verschiedenen frisch explantierten Malignomen übernommen und weiterentwickelt [55], [6]. Von Hoff und Mitarbeiter führten in den folgenden Jahren weitere Untersuchungen zur Anwendbarkeit dieser Methodik bei menschlichen Primärtumoren durch [90], [91]. Zur Verbesserung der Wachstumsbedingungen wurden in den letzten Jahren zahlreiche Substanzen auf ihre wachstumsstimulierende oder -inhibierende Wirkung untersucht. Durch Zusatz von Insulin, Hydrokortison, Transferrin, Selen und Östradiol konnte die Klonierungseffizienz, d.h. die Zahl der entstehenden Kolonien bezogen auf die eingesetzte Zellzahl erhöht werden [81], [5] ,[31]. Das Prinzip der kapillären Klonierung besteht darin, daß die mit 0,3 % Weichagar versetzte Einzelzellsuspension in 100 µl Glaskapillaren gefüllt wird, deren Enden danach mit Kitt verschlossen werden. Das Vorlegen eines "base-layer" ist dabei nicht notwendig. Nach 14-28 Tagen Exposition können die in den Kapillaren gewachsenen Kolonien unter dem Mikroskop gezählt werden, entweder direkt bei Phasenkontrasteinstellung oder nach Überführen des Kapillarinhalts auf einen Objektträger. Dieses System stellt eine wesentliche Vereinfachung gegenüber der ursprünglichen Technik dar und hat zudem folgende entscheidende Vorteile:

- Die benötigte Zellzahl pro Ansatz ist geringer, wobei trotzdem auch noch die Klonierungseffizienz bis zu 30 fach höher ist.
- Das Risiko einer Kontamination mit Bakterien und Pilzen ist geringer.
- Der materielle und technische Aufwand ist geringer, was mit einer Arbeits-, Kosten- und Platzersparnis verbunden ist [55], [90], [54], [46].

2.2.3. Anwendungsbereiche der Weichagarklonierung und Perspektiven

Die Weichagarklonierung ist heute als vielseitige in-vitro-Methode zur Kultivierung frisch explantierter Tumoren oder Tumorzellinien anerkannt. Ihren Hauptanwendungsbereich findet sie in der Chemosensitivitätstestung von Tumorzellen. Zum einen liefert sie geeignete Bedingungen, um bisher klinisch unerprobte Agenzien auf ihre antipro-liferative Aktivität zu überprüfen [79], [80]. Ein wesentlicher Vorteil ist, daß dabei direkt die Wirkung auf menschliche Tumorzellen untersucht werden kann, da eine Chemikalie, die sich beispielsweise gegenüber Leukämie bei Mäusen als inaktiv erwiesen hat, dies beim Menschen nicht unbedingt ebenso sein muß [32]. Zum anderen ermöglicht sie es, für jeden Patienten individuell und ohne jegliche Belastung, das Ansprechen (bzw. die Resistenz) eines Tumors auf unterschiedliche Zytostatika zu untersuchen und damit die Wirksamkeit in vivo vorherzusagen, was dem Kliniker ein wertvolles Hilfsmittel bei der Wahl der richtigen Chemotherapeutika sein kann [18], [53], [75], [76], [78]. Die kumulativen Daten von 2274 retro- und prospektiven klinischen Korrelationen aus zahlreichen klinischen Studien zeigten, daß eine Wahrscheinlichkeit von 69 % für ein klinisches Ansprechen besteht, wenn der Tumor in vitro sensitiv ist. Dagegen ist bei in vitro Resistenz bei 91 % der Patienten auch mit einer klinischen Resistenz zu rechnen [93], [34]. Diese Prognose zum Ansprechen des Tumorgewebes auf ein bestimmtes Medikament trifft mit größerer Wahrscheinlichkeit zu, wenn der Patient zuvor noch nicht mit einer Chemotherapie behandelt wurde [92], [98]. Trotzdem hat sich diese Methode für den routinemäßigen klinischen Gebrauch noch nicht etabliert. Als weiteren Anwendungsbereich bietet die Weichagarklonierung (HTCA) die Möglichkeit zur Untersuchung der Tumorbiologie sowie zur zytogenetischen Analyse menschlicher Tumoren [27]. Da schließlich auch normale Knochenmarkszellen in der Weichagarklonierung Kolonien bilden, kann sie auch dazu benutzt werden, bereits in vitro evtl. toxische Wirkungen von Substanzen auf das Knochenmark herauszufinden bzw. diese in vivo vorauszusagen [38]. Sofern Tumor und Knochenmark dabei vom selben Patienten entnommen werden, könnte ebenfalls eine individuelle Aussage gemacht werden und dadurch die Verabreichung von Therapeutika, die zu einer nicht vertretbaren Myelosuppression führen würden, vermieden werden [32]. Gegenüber all den vielversprechenden Einsatzmöglichkeiten steht jedoch die Tatsache, daß es bis heute nicht gelingt, jede Tumorprobe auf diese Weise zum Wachstum zu bringen. Ziel ist, ein Milieu zu finden, das den frisch explantierten Tumorzellen noch bessere Wachstumsbedingungen bietet. Ein anderes in Zukunft anzugehendes Problem ist die zeitaufwendige und ermüdende mikroskopische Zählprozedur. Dahingehende Bemühungen, ein im Routinelabor einsetzbares, automatisiertes Zählgerät zu etablieren, wurden von Hamburger et al. unternommen [5], [1]. Weiterhin stellt das nur in etwa der Hälfte der Fälle erfolgreiche Wachstum einer zu untersuchenden Tumorprobe einen Nachteil dar. Auch vergehen bis zum Erhalt des Ergebnisses ca. drei Wochen, so daß der Patient oft schon vorher mit Chemotherapeutika behandelt werden muß, deren Auswahl nur auf empirischen Daten beruht. Deshalb sind noch weitere Anstrengungen nötig, um die Untersuchungstechnik zu verbessern, und den "human tumor cloning assay" für alle Tumorpatienten nutzbar zu machen [88].

2.3. Cisplatin

2.3.1. Strukturformel und Wirkungsmechanismus

Obwohl Cisplatin bereits im Jahre 1844 von Michele Peyrone synthetisiert wurde, wurde die antitumurale Wirksamkeit erst mehr als ein Jahrhundert später, im Jahr 1969, von Barnett Rosenberg entdeckt. Dieser bemerkte zufällig das Phänomen, daß in einem Experiment Escherichia coli Bakterien in Anwesenheit von cis-Pt(NH3)2Cl2 die Fähigkeit zur Zellteilung verloren und ein filamentöses Wachstum aufwiesen. Bald kam Rosenberg der Gedanke, daß dieser Metallkomplex auch das Wachstum von Tumorzellen beeinflussen könnte, und er führte weitere Experimente mit einfachen cis-Platin-Verbindungen in experimentellen Tumormodellen durch.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: cis-Diammindichloroplatin(II), INN: Cisplatin

Obwohl gegenüber dieser Schwermetallverbindung verständlicherweise große Vorbehalte bestanden, erreichte Cisplatin das Stadium der klinischen Testung und zeigte erfreulicherweise eine gute Wirkung gegen verschiedenste Tumorentitäten. Heute wird Cisplatin häufig verwandt, meist in Kombination mit anderen Antitumorsubstanzen [74].

Bei Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus von Cisplatin wurden hauptsächlich Bindungen des Moleküls an DNA gefunden [37]. Es wird vermutet, daß diese Bindungen die DNA-Replikation behindert [48]. Die Querverbindung zwischen zwei Guaninbasen innerhalb eines DNS-Stranges ist die häufigste Bindung, die Cisplatin eingeht [40].

2.3.2. Wirkungsspektrum, Nebenwirkungen und Pharmakokinetik

In Tabelle 1 sind die Tumortypen aufgelistet, bei denen Cisplatin antineoplastische Aktivität zeigt [36]. Cisplatin dient weiterhin noch zur Sensibilisierung von Tumorgewebe für ionisierende Strahlen und wird bei mehreren Tumorarten, wie Kopf-und Halstumoren, Lungenkarzinomen, Oesophaguskarzinomen, Gehirn- und Cervixtumoren zusammen mit Strahlentherapie eingesetzt [36]. Die Anwendung einer Hyperthermiebehandlung in Kombination mit Cisplatin unter anderem auch in Verbindung mit Strahlentherapie könnte ein weiterer Weg sein, Resistenzen zu überwinden [39], [52], [85].

Die Nebenwirkungen von Cisplatin umfassen Nierentoxizität, die sich durch eine forcierte Diurese mittels Kochsalzlösungen verhindern läßt, Schwindel und Erbrechen, Sensibilitätsstörungen und den Verlust des Hörvermögens und Hypomagnesiämie. Die Knochenmarksdepression ist gewöhnlicherweise gering. Vorwiegend Patienten mit sehr hohen Dosierungen oder solche, die bereits vorbehandelt sind, können eine deutliche Myelosuppression entwickeln.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 1: Tumortypen mit klinischer Sensitivität für Cisplatin [36]

2.4. Carboplatin

2.4.1. Chemische Struktur, Wirkmechanismus und Pharmakokinetik

Carboplatin ist ein Cisplatinanalogon, in dem die zwei Chloridionen Cisplatins durch 1-Cyclobutan-Dicarboxylat substituiert sind (Abbildung 2). Carboplatin besitzt einen ähnlichen Wirkmechanismus wie Cisplatin [2]. Es reagiert mit nukleophilen Molekülen der DNS und bildet so Brücken innerhalb und zwischen Nukleotidketten und zwischen DNS und Proteinen [36]. Bei der Behandlung von Zellen mit Carboplatin benötigte man eine 20-40-fache höhere Dosis um Carboplatin im selben Maß an DNS zu binden wie mit Cisplatin. Wurde von beiden Verbindungen die gleiche DNS-Bindung erreicht, wiesen sie auch denselben Grad an Zytotoxizität auf. Die Verteilung von Carboplatin nach intravenöser Verabreichung zeigt beim Menschen einen zweiphasigen Verlauf mit t1/2 a von 98 Minuten und t1/2ß von sechs bis 24 Stunden [22]. In 24 Stunden werden 50­70% des Gesamtplatin über die Nieren ausgeschieden.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2: cis-Diammin-(1,1-cyclobutandicarboxylato)platin(II), INN: Carboplatin

2.4.2. Klinische Wirksamkeit und Nebenwirkungen

Carboplatin wurde entwickelt, um die therapeutische Breite von Cisplatin zu erhöhen und die dosislimitierenden Nebenwirkungen zu reduzieren. Klinische Studien mit Carboplatin begannen 1981. Dabei zeigt Carboplatin in der Kombinationschemotherapie von Ovarialkarzinomen eine mit Cisplatin vergleichbare Wirkung [22] . Auch in der Behandlung von Hodentumoren, sowohl Teratomen als auch Seminomen, nicht-kleinzelligen und kleinzelligen Lungentumoren und Kopf-Hals-Tumoren gilt Carboplatin als mit Cisplatin äquivalent [36].

Die Toxizitätsmuster von Carboplatin und Cisplatin unterscheiden sich hingegen, da die dosislimitierende Nebenwirkung Carboplatins in einer Knochenmarkssuppression besteht, die sich vor allem als Thrombozytopenie manifestiert. Carboplatin greift im wesentlichen in dieselben Organsysteme wie Cisplatin ein; bei größerer hämatologischer Toxizität erwies sich Carboplatin aber als weit weniger toxisch für Nieren und Gastrointestinaltrakt als Cisplatin. Eine neurotoxische Wirkung wurde nicht festgestellt [22]. Da Carboplatin in der Behandlung der Mehrzahl cisplatinsensitiver Tumoren Aktivität zeigt, stellt es eine Alternative in Fällen dar, in denen aufgrund renaler oder neuraler Schädigung gegen den Einsatz von Cisplatin Bedenken bestehen [22].

2.5. cis-Diammin-[(bis(phosphonatomethyl)amino)acetato(2-)-O1,N1]platin(II) (KP 735)

2.5.1. Chemische Struktur und Physikalisch-chemische Eigenschaften

Bei der Substanz KP 735, Molekularformel C3H17PtO8N3P2, handelt es sich um ein technisch synthetisiertes, cis-Diammin enthaltendes Platin mit einer Aminoacetato-gruppe, an dessen Stickstoffatom wiederum zwei Phosphonatomethylgruppen gebunden sind. Platin hat in dieser Form die Oxidationszahl 2. Die relative Molekularmasse beträgt 490,22. Die Substanz liegt in makroskopischer Form als weiß-gelbliches Pulver vor und ist in Reinform bei -20°C stabil. Sie ist in einer 0,9 prozentigen Natriumchloridlösung in einer Konzentration von 1 mg/ml gut löslich und bei -70°C stabil. Je nach Konzentration erscheint d ie KP 735 - Lösung als gelbliche bis klare Flüssigkeit. Die Abbildung 3 verdeutlicht die chemische Strukturformel von KP 735.

Die Phosphonsäuregruppen, die an Platin gebunden sind, können von freien Phosohonsäuren unterschieden werden durch Unterschiede in den Signalen der 31P NMR.

Die 13C NMR zeigt einen deutlichen Unterschied der Signale zwischen den Kohlenstoffatomen in den freien Liganden und denen im Metallkomplex, siehe auch Abbildung 3.

Die Anwesenheit von gebundenen Carboxyl-Gruppen kann einfach durch Infrarot-Spektroskopie nachgewiesen werden [42 ], siehe auch Abbildung 3.

Obwohl diese Metallkomplexe insgesamt kaum auskristallisieren, konnten bei KP 735 Kristalle von einer Qualität erhalten werden, die für die Röntgen Strukturanalyse tauglich sind [42]. Die daraus erhaltene Struktur wird zusammen mit ausgewählten Bindungsabständen (Å) und Winkeln (°) in Abbildung 4 gezeigt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 3: Infrarot-Spektroskopie und NMR bei cis-Diammin-[(bis(phos-phonatomethyl)amino)acetato(2-)-O1,N1]platin(II) KP 735 [42 ]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 4: Röntgen Strukturanalyse mit ausgewählten Bindungsabständen (Å) und Winkeln (°) von KP 735

2.5.2. Herstellung

Die Substanz KP 735 setzt sich aus dem zentral sitzenden Platinatom und den daran gebundenen zwei Amino-Gruppen und einer Aminoacetato-Gruppe, an dessen Stickstoffatom wiederum zwei Phosphonatomethylgruppen gebunden sind, zusammen. Zur Synthese wird das Diammin-Platin-Chlorid2 mit Silbernitrat oder Silbersulfat aktiviert. Der resultierende Komplex kann bei Aktivierung mit Silbersulfat dann direkt mit Phosphonsäuren reagieren. Bei Aktivierung mit Silbernitrat muß das resultierende Nitrat zuerst mit einem Ionenaustauscher ausgewaschen werden, bevor es weiter mit Phosphonsäuren reagieren kann [42].

Die daraus entstehende Verbindung cis-Diammin-[(bis(phosphonatomethyl)ami-no)acetato(2-)-O1,N1]platin(II) (KP 735) wurde dann mittels Elementanalyse und verschiedenen spektroskopischen Methoden charakterisiert. Die hohe Reinheit von KP 735 wurde durch chromatographische Untersuchungen HPLC bestätigt [42].

2.5.3. Untersuchungen zur Interaktion von Platinverbindungen mit Biomolekülen

Die meisten Untersuchungen zum Wirkmechanismus von Cisplatin ergaben als Hauptangriffsort der Substanz die DNS. Welche Art von DNS-Schädigung durch Cisplatin aber hauptsächlich für die zytotoxische und antitumorale Wirkung verantwortlich ist, ist auch heute noch eine offene Frage [37]. Platin(II)-Verbindungen können auf verschiedene Arten an DNS binden. Es gibt die Möglichkeit der Anlagerung von Platin an N(7) zweier aufeinanderfolgender Guaninbasen [d(GpG) bzw. d(GpNpG)] oder an N(7) einer Adenin-Guaninbasenfolge [d(ApG) bzw. d(ApNpG)]. In etwa einem Prozent der Fälle verbindet Cisplatin zwei DNS-Stränge durch Bindung an Guaninbasen zweier komplementärer Nukleotidketten [37]. Die DNS-Replikation wird durch diese DNS-Cisplatin-Brücken, vor allem der Art d(GpG), verhindert. Durch die Bindung von Cisplatin an zwei aufeinanderfolgende Guaninbasen wird die DNS-Struktur an dieser Stelle unterbrochen und die komplementären Cytosinbasen sind somit nicht mehr an die Adenosinbasen gepaart. Weiterhin erfährt die DNS-Helixachse durch die Bindung des cis-Pt(II)-Komplexes an die N7-Position zweier benachbarter Guaninbasen einen Knick [48]. Das trans-Pt(II)-Isomer von Cisplatin hat eine sehr viel geringere Zytotoxizität und keine antitumorale Wirkung, obwohl es in der Lage ist, an DNS zu binden.

Um den Wirkmechanismus von Cisplatin besser zu verstehen, wurden Untersuchungen über den biologischen Unterschied zwischen der cis- und der trans-Form der Substanz durchgeführt. Dabei zeigte sich, daß nur das cis-Isomer in Säuger-Zellen zwei DNS-Stränge verbinden kann [99]. Das trans-Isomer kann aufgrund seiner Geometrie aufeinanderfolgende Basen eines Nukleotidstranges nicht verbinden. Es verbindet zwei Guanin- oder Adeninbasen unter Auslassung einer dazwischen liegenden Base. Diese Art der Bindung wird seltener auch von Cisplatin eingegangen. Das trans-Isomer produziert mehr DNS-Protein-Verbindungen als Cisplatin . Aus diesen Beobachtungen kann geschlossen werden: Die Verbindung zweier DNS-Stränge durch Cisplatin ist für die Zytotoxizität von Cisplatin wichtig, obwohl sie nur 1% der möglichen Addukte ausmacht, da das trans-Isomer dazu nicht in der Lage ist. Eine andere Möglichkeit ist, daß die Art der Verbindung zwischen Basen eines DNS-Stranges, die Cisplatin herstellt, sehr viel zytotoxischer sind als diejenigen des trans-Isomers. Nicht ausreichend geklärt ist, ob Cisplatin eine besonders zytotoxische DNS-Protein-Bindung vermittelt.

Die Gründe für die hohe Toxizität von Cisplatin und die niedrige Toxizität von trans-Pt(II) sind insgesamt soweit noch weitgehend unklar . Daher wurden auch andere Erklärungsversuche zum Wirkmechanismus vorgebracht. Zu nennen wären hier die Störung des transmembranalen Transports essentieller Aminosäuren in manchen cisplatinsensitiven Zellen oder die Störung des Zellelektrolythaushaltes durch Cisplatin [26], [66].

2.5.4. Hypothesen zum antitumoralen Wirkungsmechanismus

Galeano et al. diskutieren die Möglichkeit, daß Platinverbindungen durch Kopplung mit bestimmten Molekülen besondere Affinität zu bestimmten Geweben bzw. Kompartimenten des menschlichen Körpers erhalten sollen. Auch das Aktivitätsprofil könnte bei der Edelmetallverbindung KP 735 so modifiziert sein, daß eine inaktive Vorstufe erst nach erreichen bestimmter Gewebe bzw. durch Verstoffwechselung zur aktiven Substanz verändert wird [23].

2.5.5. Präklinische Untersuchungen zur Wirksamkeit von KP 735

Da Cisplatin bei kolorektalen Karzinomen relativ gering wirksam ist, wurde an mittels Acetoxymethyl-methylnitrosamin (AMMN) induzierten Dickdarmtumoren von Ratten der Effekt von neuen antitumoralen Substanzen getestet [7]. Neben Titan- und Rutheniumverbindungen wurden folgende drei Phosphonsäuregekoppelten Platinverbindungen untersucht:

- cis-Diammin-[(bis(phosphonatomethyl)amino)-acetato(2-)-O1,N1]platin(II), (DBP) = (KP 735)
- cis-Diammin-[nitrilotris(methylphosphonato)(2-)-O1,N1]platin(II), (AMDP)
- cis-[Cyclohexane-1,2-diammin]nitrilotris(methylphosphonato)(2-)-O1,N1]platin(II), (DADP)

Dabei zeigte KP 735 bei lokaler Einmalapplikation von 31,2 mg/kg zweimal pro Woche über eine Dauer von zehn Wochen therapeutische Effekte - das Tumorvolumen wurde auf 44 % des Vorbefundes verringert und die Anzahl der Tumoren betrug nach Behandlung nur mehr 75% des Ausgangswertes [7].

Weitere Anstrengungen wurden unternommen, um die antineoplastische Aktivität von KP 735 auf das transplantable Osteosarkom (Zellklone C25 und C36) der Ratte in vivo zu untersuchen.

Zuerst wurden Tumorfragmente 12 bis 15 Tage alten Ratten intratibial inokluiert. Die Behandlung erstreckte sich über drei Wochen, beginnend am Tag 21 nach der Transplantation mit zwei intravenösen Injektionen pro Woche. Zur Auswertung wurde der Parameter T/C% (Mittleres Tumorvolumen der behandelten Gruppe gegen das der Kontrollgruppe in Prozent) am Tag 42 nach Transplantation, ÜLZ% (Verlängerung der Überlebenszeit der behandelten Gruppe gegen das der Kontrollgruppe in Prozent) und KGD% (Körpergewicht der behandelten Gruppe gegen das der Kontrollgruppe in Prozent) am Tag 42 nach Transplantation herangezogen.

Die Tabelle 2 gibt einen Überblick über die resultierenden Wirkungen, wobei der Körpergewichtseffekt nach Geschlecht differenziert wird [41], [44].

Es zeigt sich, daß bei höherer Einzel- bzw. Gesamtdosis eine stärkere Tumorhemmung eintritt, wie an den T/C%-Werten abgelesen werden kann. Ebenfalls Dosisabhängig ist die Verlängerung der Überlebenszeit. Durch die Therapie war bei den männlichen Tieren die Zunahme des Körpergewichts gegenüber der unbehandelten Kontrollgruppe verlangsamt; diese Verzögerung wurde jedoch im weiteren Verlauf nach dem Absetzen der Therapie wieder aufgeholt [41], [44].

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 2: Untersuchungsergebnisse nach Therapie mit KP 735 am transplantablen Osteosarkom C25 und C36 der Ratte

Die Substanz KP 735 bewirkte in beiden Dosierungen jeweils eine deutliche Verlängerung der Überlebenszeit (ÜLZ %). Es fiel auf, daß bei den männlichen Tieren die Zunahme des Körpergewichts verzögert war, jedoch wurde festgestellt, daß diese Tiere sich nach Absetzen der Therapie wieder erholten und eine beachtliche Überlebenszeit erreichten, und dies trotz des starken Untergewichts während der Therapiephase [41], [44].

T/C% = Mittleres Tumorvolumen der behandelten Gruppe gegen das der Kontrollgruppe in Prozent am Tag 42 nach Transplantation

ÜLZ% = Verlängerung der Überlebenszeit der behandelten Gruppe gegen das der Kontrollgruppe in Prozent

KGD% = Körpergewicht der behandelten Gruppe gegen das der Kontrollgruppe in Prozent am Tag 42 nach Transplantation

[41], [44]

2.5.6. Toxikologische Daten

Zu Beginn von pharmakologischen Untersuchungen stellt sich immer die Frage, wie hoch man eine neue Substanz dosieren kann oder welche Einzeldosis bzw. welche Gesamtdosis von einem bestimmten Medikament selbst von gesunden Versuchstieren überlebt wird. Einen üblichen Vergleichsparameter stellt hier die LD50 dar, das ist diejenige Dosis eines Stoffes, bei deren Verabreichung die Hälfte der Versuchstiere sterben. Zur Ermittlung der LD50 von KP 735 wurde die intravenöse Applikation einer wäßrigen Lösung an weiblichen NMRI Mäusen gewählt. Dabei ergibt sich eine Dosis von größer 600 mg/kg KP 735 Körpergewicht [42].

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