Molecular characterization and identification of antigen 32-5B6 as enzyme S-Adenosyl-L-Homocystein-Hydrolase from Xenopus laevis oocyte nuclei

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

1.1. Der Proteintransport in den Zellkern

1.2. Die Kernlokalisationssequenz

1.3. Modell für den Transport eines Proteins in den Zellkern

1.4. Zeitlich regulierter Kerntransport während der Frühentwicklung

1.5. Aufgabenstellung

2. Ergebnisse

2.1. Screening einer aus Xenopus laevis Ovar stammenden cDNA-Bibliothek

2.2. „in vivo excision“ der pBluescript(-) Plasmide aus dem Lambda Zap II Vektor

2.3. Überprüfung der pBluescript(-)Plasmide auf darin enthaltene cDNA

2.4. Restriktionskartierung der cDNA

2.5. Plasmid-Doppelstrang-Sequenzierung

2.6. Aufreinigung des Antigens 32-5B6 über Anionenaustauscher-Chromatographie

2.7. Die zweidimensionale Gelelektrophorese

2.8. Protein-Mikrosequenzierung

3. Diskussion

4. Zusammenfassung

5. Material und Methoden

5.1. Material

5.1.1. Medien und Lösungen für Bakterien

5.1.2. Lösungen für DNA-Präparationen

5.1.3. Lösungen für Proteinextraktion

5.1.4. Puffer und Lösungen für die Sequenzierungsreaktion

5.1.5. Puffer für Elektrophoresen

5.1.6. Agarplatten

5.1.7. Herstellung von Glycerinkulturen

5.1.8. Herstellung von ÜN-Kulturen

5.1.9. Puffer und Lösungen der zweidimensionalen Gelelektrophorese

5.2. Methoden

5.2.1. Bestimmung des Phagentiters

5.2.2. Antikörperscreening der Xenopus-Ovar-cDNA-Bibliothek

5.2.3. Vereinzelung der Kolonien

5.2.4. „in vivo excision“

5.2.5. Plasmidpräparation nach Quiagen

5.2.6. Behandlung von DNA mit Restriktionsendonukleasen

5.2.7. Agarosegelelektrophorese

5.2.8. DNA-Sequenzierung mit dem A.L.F-express

5.2.9. Zweidimensionale Gelelektrophorese (praktische Durchführung)

5.3. Anionenaustauscherchromatographie über Source Q unter FPLC-Einsatz

5.3.1. Herstellung von Oocyten-Proteinextrakt

5.3.2. Aufreinigung des Antigens 32-5B6 über die Anionenaustauschersäule Source Q unter FPLC-Einsatz

5.3.3. Dot Blot-Analyse des Antigens 32-5B6

Zielsetzung & Themen

Die vorliegende Arbeit zielt auf die molekulare Charakterisierung des Antigen 32-5B6 ab, welches in Oocyten des Krallenfrosches Xenopus laevis vorkommt. Dabei steht die zentrale Forschungsfrage im Mittelpunkt, ob dieses Protein eine spezifische Kernlokalisationssequenz besitzt, die den Transport in den Zellkern während der Embryonalentwicklung steuert.

• Molekulare Charakterisierung des Antigens 32-5B6
• Isolierung und Sequenzierung entsprechender cDNA-Klone
• Protein-Mikrosequenzierung und Abgleich mit Gendatenbanken
• Analyse des Proteintransports und der Kernlokalisationssignale
• Untersuchung der Expression und Funktion im Kontext der frühen Embryonalentwicklung

Auszug aus dem Buch

Zusammenfassung der Kapitel

1. Einleitung: Dieses Kapitel erläutert den Mechanismus des Proteintransports in den Zellkern sowie die Bedeutung von Kernlokalisationssequenzen und die Aufgabenstellung der Arbeit.

2. Ergebnisse: Hier werden die experimentellen Schritte zur Isolierung, Sequenzierung und Charakterisierung der cDNA sowie die biochemische Aufreinigung und Analyse des Antigens 32-5B6 dargestellt.

3. Diskussion: Das Kapitel vergleicht die gewonnenen Sequenzdaten mit bestehenden Datenbanken und diskutiert die Identität des Antigens 32-5B6 als S-Adenosyl-L-Homocystein-Hydrolase.

4. Zusammenfassung: Eine komprimierte Darstellung der erzielten Ergebnisse, die die Identifizierung des Antigens und die noch offenen Fragen hinsichtlich des Kerntransports zusammenfasst.

5. Material und Methoden: Dieser Abschnitt beschreibt detailliert die verwendeten Chemikalien, Puffer, Medien und die wissenschaftlichen Protokolle für die molekularbiologischen und biochemischen Analysen.

Schlüsselwörter

Xenopus laevis, Antigen 32-5B6, Kernlokalisationssequenz, Proteintransport, cDNA-Bibliothek, S-Adenosyl-L-Homocystein-Hydrolase, Gelelektrophorese, Protein-Mikrosequenzierung, Embryonalentwicklung, DNA-Methylierung, FPLC, Anionenaustauscherchromatographie, Molekularbiologie, Gensequenzierung, Antikörper-Screening.

Häufig gestellte Fragen

Worum geht es in dieser Diplomarbeit primär?

Die Arbeit befasst sich mit der molekularen Charakterisierung des Antigens 32-5B6 aus Oocytenkernen des Krallenfrosches Xenopus laevis.

Was sind die thematischen Schwerpunkte der Forschung?

Zentrale Themen sind der Proteintransport in den Zellkern, die Sequenzanalyse von cDNA-Klonen und die Identifizierung des untersuchten Proteins im biochemischen Kontext.

Welche Forschungsfrage steht im Zentrum?

Es wird untersucht, ob das Antigen 32-5B6 eine spezifische Kernlokalisationssequenz besitzt, die seine Aufnahme in den Zellkern während der Embryonalentwicklung steuert.

Welche wissenschaftlichen Methoden kommen zum Einsatz?

Verwendet wurden unter anderem cDNA-Bibliotheks-Screening, Plasmid-Sequenzierung, zweidimensionale Gelelektrophorese und Anionenaustauscher-Chromatographie.

Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?

Der Hauptteil dokumentiert die Isolierung der cDNA, die Restriktionskartierung, die Sequenzvergleiche mit Gendatenbanken und die Proteinreinigung mittels FPLC.

Welche Begriffe charakterisieren die Arbeit am besten?

Wichtige Begriffe sind Xenopus laevis, Kernlokalisationssequenz, Proteintransport, cDNA-Bibliothek und S-Adenosyl-L-Homocystein-Hydrolase.

Wie wurde die Identität des Antigens 32-5B6 bestätigt?

Die Identität wurde durch den Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz der cDNA-Klone mit Protein-Mikrosequenzierungsdaten sowie den Abgleich mit in der Genbank gelisteten Sequenzen der S-Adenosyl-L-Homocystein-Hydrolase bestätigt.

Welche Rolle spielt die S-Adenosyl-L-Homocystein-Hydrolase in dieser Untersuchung?

Die Analysen legen nahe, dass das Antigen 32-5B6 dieses Enzym oder eine nahe verwandte Variante ist, welche eine wichtige Rolle im Stoffwechsel der Schwefelgruppen-Übertragung spielt.