Untersuchung der Bildung von 4-Hydroxyvaleriansäure innerhalb des Lävulinsäuremetabolismus von "Ralstonia eutropha"

Inhaltsverzeichnis

• Einleitung
• Das Bakterium Ralstonia eutropha
• Bildung, Vorkommen und industrielle Bedeutung von Polyhydroxyfettsäuren (PHF)
• Der Lävulinsäurestoffwechsel in Ralstonia eutropha
• Zielsetzung dieser Arbeit
• Material und Methoden
• Organismen und Plasmide
• Nährmedien
• Mineralmedium (SCHLEGEL ET AL., 1961)
• Spurenelementlösung SL6 (PFENNIG, 1974)
• NB-Medium (SAMBROOK ET AL., 1989)
• Luria-Bertani (LB)-Medium (SAMBROOK ET AL., 1989)
• X-Gal-Medium (SAMBROOK ET AL., 1989)
• M9-Medium (SAMBROOK ET AL., 1989)
• Herstellung von Substraten
• Antibiotika
• Synthese von 4-Hydroxyvaleriansäure
• Synthese von Acyl-Coenzym-A-Thioestern
• Synthese von Lävulinyl-CoA (KAWAGUCHI ET AL., 1981)
• Synthese von 4-Hydroxyvaleryl-CoA
• Nachweis der Acyl-CoA-Synthese (PULLMANN, 1973)
• Stammkonservierung und Reinheitskontrolle
• Zellanzucht
• Wachstumsbedingungen und Zellernte
• Herstellung von Rohextrakten
• Wachstumsparameter
• Reinigung der Butyratkinase und der Phosphotransbutyrylase aus E. coli PJC7 (LIU UND STEINBÜCHEL, 2000)
• Proteinbestimmung (BRADFORD, 1976)
• Photometrische Bestimmung von Enzymaktivitäten
• Lävulinyl-CoA-Reduktase
• Lävulinyl-CoA-Transferase
• Butyratkinase
• Phosphotransbutyrylase
• Gaschromatographie
• Veresterung mit Methanol/Schwefelsäure
• Analyse mittels Gaschromatographie
• Denaturierende, diskontinuierliche SDS-PAGE (LAEMMLI, 1970)
• Unspezifische Proteinfärbung mit Coomassie Brilliant Blue in Polyacrylamidgelen (WEBER und OSBORN, 1969)
• Zweidimensionale Proteinelektrophorese mit immobilisiertem pH-Gradienten (CORBETT, 1994, HANNA ET AL., 2000)
• Zellanzucht
• Zellernte
• Zellaufschluß und Proteinfällung
• Vorbereitung der Proben für die isoelektrische Fokussierung
• Quellen der isoelektrischen Fokussierungsstreifen
• Isoelektrische Fokussierung (1. Dimension)
• Denaturierende SDS-PAGE (2. Dimension)
• Kolloidale Coomassie-Färbung (NEUHOFF ET AL., 1985)
• Analyse von Proteinproben
• Gel-Elektrophoresen zur Trennung von DNA-Fragmenten
• Agarosegel-Elektrophorese (AGE)
• Polyacrylamidgel-Elektrophorese für die nichtradioaktive DNA-Sequenzierung
• Isolierung von DNA
• Schnelle Präparation von Gesamt-DNA
• Isolierung von Gesamt-DNA (MARMUR, 1961)
• Isolierung von Plasmid-DNA (BIRNBOIM & DOLY, 1979)
• Isolierung von Plasmid-DNA für die Sequenzierung
• Isolierung von DNA-Fragmenten durch Adsorption an "Glasmilch" (VOGELSTEIN & GILLESPIE, 1979)
• Reinigung und Konzentrierung von DNA
• Extraktion mit Phenol/Chloroform
• Ethanol-Präzipitation
• Filterblatt-Dialyse
• Aufarbeitung von DNA
• Verdauung von DNA durch Restriktionsendonucleasen
• Ligation von DNA-Fragmenten
• Analyse von DNA-Präparationen
• Konzentrationsbestimmung von DNA
• Größenbestimmung von DNA-Fragmenten
• Transfer von DNA
• Herstellung und Konservierung dauerhaft kompetenter Zellen (HANAHAN, 1983)
• Herstellung kompetenter Zellen von E. coli durch die CaCl2-Methode (SAMBROOK ET AL., 1989)
• Transformation von E. coli-Zellen
• Konjugation („Spotmating“) (FRIEDRICH ET AL. 1981)
• Polymerasekettenreaktion (PCR)
• DNA-Sequenzierung
• Sequenzier-Reaktion
• Auswertung der Sequenzdaten
• Chemikalien, Biochemikalien und Enzyme

Zielsetzung und Themenschwerpunkte

Diese Diplomarbeit befasst sich mit der Bildung von 4-Hydroxyvaleriansäure innerhalb des Lävulinsäurestoffwechsels des Bakteriums Ralstonia eutropha HF39. Das Ziel dieser Arbeit ist die Aufklärung der Rolle des ler-Gens bei der Synthese von 4-Hydroxyvaleriansäure.

• Charakterisierung des ler-Gens und seiner Funktion im Lävulinsäurestoffwechsel
• Untersuchung der Expression des ler-Gens in Ralstonia eutropha HF39
• Analyse des Einflusses des ler-Gens auf die Bildung von 4-Hydroxyvaleriansäure
• Untersuchung des phänotypischen Verhaltens einer ler-Deletionsmutante von Ralstonia eutropha HF39
• In-vitro-Analyse der enzymatischen Aktivität des Ler-Proteins

Zusammenfassung der Kapitel

Die Arbeit beginnt mit einer Einleitung, die das Bakterium Ralstonia eutropha, die Bildung und Bedeutung von Polyhydroxyfettsäuren (PHF) sowie den Lävulinsäurestoffwechsel in Ralstonia eutropha beschreibt. Anschließend werden die Materialien und Methoden der Arbeit ausführlich vorgestellt. Der Schwerpunkt liegt dabei auf der Charakterisierung des ler-Gens, der Konstruktion einer ler-Deletionsmutante, der Analyse des phänotypischen Verhaltens dieser Mutante sowie der enzymatischen Untersuchungen zur Bildung von 4-Hydroxyvaleriansäure. Die Ergebnisse der Arbeit werden im Anschluss präsentiert und detailliert diskutiert.

Schlüsselwörter

Ralstonia eutropha, Lävulinsäurestoffwechsel, 4-Hydroxyvaleriansäure, Polyhydroxyfettsäuren, ler-Gen, Genexpression, Deletionsmutante, Enzymaktivität.

Häufig gestellte Fragen

Was ist das Ziel der Forschung an Ralstonia eutropha?

Ziel war die Identifizierung einer Lävulinatreduktase, um aus Lävulinsäure die Vorstufe 4-Hydroxyvaleriansäure für die Produktion von Biopolymeren (PHF) zu gewinnen.

Was ist das „ler-Gen“ in diesem Prozess?

Das ler-Gen wurde als potenzieller Kandidat für die Steuerung der Synthese von 4-Hydroxyvaleriansäure im Lävulinsäurestoffwechsel des Bakteriums untersucht.

Welche molekularbiologischen Methoden wurden angewandt?

Es wurden Gen-Deletionen, PCR, DNA-Sequenzierung sowie zweidimensionale Proteinelektrophorese (2-D-Gele) zur Identifizierung von Protein-Kandidaten genutzt.

Was sind Polyhydroxyfettsäuren (PHF)?

PHF sind biologisch abbaubare Kunststoffe (Biopolymere), die von Bakterien wie Ralstonia eutropha als Speicherstoffe produziert werden können.

Wie wurde die Bildung von Fettsäuren nachgewiesen?

Der Nachweis erfolgte mittels Gaschromatographie nach einer Veresterung der Proben mit Methanol/Schwefelsäure.