Untersuchung der Bildung von 4-Hydroxyvaleriansäure innerhalb des Lävulinsäuremetabolismus von "Ralstonia eutropha"

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

1.1 Das Bakterium Ralstonia eutropha

1.2 Bildung, Vorkommen und industrielle Bedeutung von Polyhydroxyfettsäuren (PHF)

1.3 Der Lävulinsäurestoffwechsel in Ralstonia eutropha

1.4 Zielsetzung dieser Arbeit

2. Material und Methoden

2.1 Organismen und Plasmide

2.2 Nährmedien

2.2.1 Mineralmedium (SCHLEGEL ET AL., 1961)

2.2.2 Spurenelementlösung SL6 (PFENNIG, 1974)

2.2.3 NB-Medium (SAMBROOK ET AL., 1989)

2.2.4 Luria-Bertani (LB)-Medium (SAMBROOK ET AL., 1989)

2.2.5 X-Gal-Medium (SAMBROOK ET AL., 1989)

2.2.6 M9-Medium (SAMBROOK ET AL., 1989)

2.2.7 Antibiotika

2.3 Herstellung von Substraten

2.3.1 Synthese von 4-Hydroxyvaleriansäure

2.3.2 Synthese von Acyl-Coenzym-A-Thioestern

2.3.2.1 Synthese von Lävulinyl-CoA (KAWAGUCHI ET AL., 1981)

2.3.2.2 Synthese von 4-Hydroxyvaleryl-CoA

2.3.2.3 Nachweis der Acyl-CoA-Synthese (PULLMANN, 1973)

2.4 Stammkonservierung und Reinheitskontrolle

2.5 Zellanzucht

2.5.1 Wachstumsbedingungen und Zellernte

2.5.2 Wachstumsparameter

2.6 Herstellung von Rohextrakten

2.7 Reinigung der Butyratkinase und der Phosphotransbutyrylase aus E. coli pJC7 (LIU UND STEINBÜCHEL, 2000)

2.8 Proteinbestimmung (BRADFORD, 1976)

2.9 Photometrische Bestimmung von Enzymaktivitäten

2.9.1 Lävulinyl-CoA-Reduktase

2.9.2 Lävulinyl-CoA-Transferase

2.9.3 Butyratkinase

2.9.4 Phosphotransbutyrylase

2.10 Gaschromatographie

2.10.1 Veresterung mit Methanol/Schwefelsäure

2.10.2 Analyse mittels Gaschromatographie

2.11 Denaturierende, diskontinuierliche SDS-PAGE (LAEMMLI, 1970)

2.11.1 Unspezifische Proteinfärbung mit Coomassie Brilliant Blue in Polyacrylamidgelen (WEBER und OSBORN, 1969)

2.12 Zweidimensionale Proteinelektrophorese mit immobilisiertem pH-Gradienten (CORBETT, 1994, HANNA ET AL., 2000)

2.12.1 Zellanzucht

2.12.2 Zellernte

2.12.3 Zellaufschluß und Proteinfällung

2.12.4 Vorbereitung der Proben für die isoelektrische Fokussierung

2.12.5 Quellen der isoelektrischen Fokussierungsstreifen

2.12.6 Isoelektrische Fokussierung (1. Dimension)

2.12.7 Denaturierende SDS-PAGE (2. Dimension)

2.12.8 Kolloidale Coomassie-Färbung (NEUHOFF ET AL., 1985)

2.12.9 Analyse von Proteinproben

2.13 Gel-Elektrophoresen zur Trennung von DNA-Fragmenten

2.13.1 Agarosegel-Elektrophorese (AGE)

2.13.2 Polyacrylamidgel-Elektrophorese für die nichtradioaktive DNA-Sequenzierung

2.14 Isolierung von DNA

2.14.1 Schnelle Präparation von Gesamt-DNA

2.14.2 Isolierung von Gesamt-DNA (MARMUR, 1961)

2.14.3 Isolierung von Plasmid-DNA (BIRNBOIM & DOLY, 1979)

2.14.4 Isolierung von Plasmid-DNA für die Sequenzierung

2.14.5 Isolierung von DNA-Fragmenten durch Adsorption an "Glasmilch" (VOGELSTEIN & GILLESPIE, 1979)

2.15 Reinigung und Konzentrierung von DNA

2.15.1 Extraktion mit Phenol/Chloroform

2.15.2 Ethanol-Präzipitation

2.15.3 Filterblatt-Dialyse

2.16 Aufarbeitung von DNA

2.16.1 Verdauung von DNA durch Restriktionsendonucleasen

2.16.2 Ligation von DNA-Fragmenten

2.17 Analyse von DNA-Präparationen

2.17.1 Konzentrationsbestimmung von DNA

2.17.2 Größenbestimmung von DNA-Fragmenten

2.18 Transfer von DNA

2.18.1 Herstellung und Konservierung dauerhaft kompetenter Zellen (HANAHAN, 1983)

2.18.2 Herstellung kompetenter Zellen von E. coli durch die CaCl2-Methode (SAMBROOK ET AL., 1989)

2.18.3 Transformation von E. coli-Zellen

2.18.4 Konjugation („Spotmating“) (FRIEDRICH ET AL. 1981)

2.19 Polymerasekettenreaktion (PCR)

2.20 DNA-Sequenzierung

2.20.1 Sequenzier-Reaktion

2.20.2 Auswertung der Sequenzdaten

2.21 Chemikalien, Biochemikalien und Enzyme

3. Ergebnisse

3.1 Amplifizierung und Klonierung des ler-Gens

3.2 Heterologe Expression von ler

3.3 Konstruktion einer „Knock-out“-Mutante von R. eutropha HF39 im ler-Gen

3.4 Phänotypische Charakterisierung der ler-Deletionsmutante

3.5 Analyse des Proteinmusters von R. eutropha HF39 nach Disruption des ler-Gens

3.6 Synthese von Lävulinyl-CoA und 4-Hydroxyvaleryl-CoA

3.7 Enzymtests

3.7.1 In-vitro-Test: Reduktion von Lävulinsäure zu 4-Hydroxyvalerat bzw. Lävulinyl-CoA zu 4-Hydroxyvaleryl-CoA durch Rohextrakte von E. coli XL1-Blue (pBluescript SK-/ler) und R. eutropha HF39

3.7.1.1 Bestimmung der Enzymaktivität von Ler mit Lävulinsäure und NADH+H+ bzw. NADPH+H+ als Cofaktoren im Rohextrakt von E. coli XL1-Blue (pBluescript SK-/ler)

3.7.1.2 Bestimmung der Enzymaktivität von Ler mit Lävulinyl-CoA und NADH+H+ bzw. NADPH+H+ als Cofaktoren im Rohextrakt von E. coli XL1-Blue (pBluescript SK-/ler)

3.7.1.3 Bestimmung von Lävulinsäure-/Lävulinyl-CoA-Reduktaseaktivität im Rohextrakt von R. eutropha HF39

3.7.2 Nachweis der 4HV-CoA-Bildung mittels Gaschromatographie (GC)

3.7.3 Synthese von Lävulinyl-CoA durch Rohextrakt von R. eutropha HF39

3.8 Quantifizierung des 4-HV-Umsatzes durch Mutanten von R. eutropha HF39

3.9 Identifizierung Lävulinat-induzierter Enzyme mittels zweidimensionaler (2-D-) Gelelektrophorese

3.9.1 Präparation von 2-D-Gelen

3.9.2 Analyse Lävulinat-spezifischer Proteine

3.9.3 Analyse 4-HV-spezifischer Proteine

3.9.4 Zeitliche Änderung des Proteinmusters von R.xeutropha-Rohextrakten nach Induktion mit Lävulinsäure

4. Diskussion

4.1 Amplifizierung, Klonierung und heterologe Expression des ler-Gens

4.2 Konstruktion einer „Knock-out“-Mutante von R. eutropha HF39 im ler-Gen

4.3 Phänotypische Charakterisierung der ler-Deletionsmutanten

4.4 Synthese von Lävulinyl-CoA bzw. 4HV-CoA

4.5 In-vitro-Test: Reduktion von LA zu 4HV bzw. LA-CoA zu 4HV-CoA durch Rohextrakte von E. coli XL1-Blue (pBluescriptSK/ler) und R.xeutropha HF39

4.6 Nachweis der Bildung von 4HV-CoA mittels Gaschromatographie (GC)

4.7 Synthese von Lävulinyl-CoA durch Rohextrakt von R. eutropha HF39

4.8 Quantifizierung des 4-HV-Umsatzes durch die fadE- und ler-Mutanten von R. eutropha HF39

4.9 Identifizierung von Proteinen mittels 2-D-Gelelektrophorese

4.9.1 Analyse von Proteinen, die spezifisch auf LA gebildet werden

4.9.2 Analyse von Proteinen, die spezifisch auf 4HV gebildet werden

4.9.3 Zeitliche Änderung des Proteinspektrums von R. eutropha nach Induktion der Zellen mit Lävulinsäure

4.9.4 Abschließende Bemerkungen zur Identifizierung unbekannter Proteine mittels 2-D-Gelelektrophorese

4.10 Hypothesen zum alternativen Abbau von LA

4.10.1 Potentielle Reduktion von Lävulinyl-CoA durch unspezifische Ketoacyl-Reduktasen

4.10.2 Modell eines alternativen Stoffwechselweges

4.10.3 Beteiligung von Glutathion-S-Transferasen am LA-Abbau

4.10.4 Mögliche Beteiligung einer Glutaryl-CoA-Dehydrogenase und einer Crotonase am Lävulinsäurekatabolismus

4.11 Ausblick

4.11.1 Test auf Lävulinyl-CoA-Reduktaseaktivität anderer Enzyme

4.11.2 Weiterführende Experimente mittels 2-D-Elektrophorese

4.11.3 Reinigung der Lävulinat-Reduktase

4.11.4 Identifizierung des Lävulinat-Reduktasegens mittels DNA-Schutzexperimenten

5. Zusammenfassung

6. Literatur

Zielsetzung & Themen

Die vorliegende Arbeit untersucht den Lävulinsäurestoffwechsel des Bakteriums Ralstonia eutropha HF39, insbesondere mit dem Ziel, den Stoffwechselweg von Lävulinsäure (LA) zu 4-Hydroxyvaleriansäure (4HV) aufzuklären. Dabei soll überprüft werden, ob ein spezifisch bei LA-Wachstum exprimiertes 32,3 kDa Protein (bezeichnet als Ler) als Lävulinatreduktase fungiert, indem das entsprechende Gen heterolog in E. coli exprimiert, phänotypisch charakterisiert und im Wildtyp deletiert wird.

• Biotechnologische Produktion von Polyhydroxyfettsäuren (PHF)
• Stoffwechselwege von Lävulinsäure in Ralstonia eutropha
• Funktion des ler-Gens und Identifizierung potenzieller LA-Reduktasen
• Proteomanalyse mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese
• Synthese von Acyl-CoA-Thioestern für In-vitro-Enzymtests

Auszug aus dem Buch

Zusammenfassung der Kapitel

1. Einleitung: Beschreibt die Eigenschaften von R. eutropha, die Bedeutung von Polyhydroxyfettsäuren sowie den bekannten Stoffwechsel von Lävulinsäure und die Zielsetzung der Untersuchung.

2. Material und Methoden: Detaillierte Auflistung der verwendeten Organismen, Plasmide, Nährmedien, Synthesemethoden für Substrate sowie der analytischen Verfahren wie SDS-PAGE, Gaschromatographie und DNA-Isolierung.

3. Ergebnisse: Dokumentation der Klonierung, Expression und Disruption des ler-Gens sowie der Enzymtests und der 2-D-Gelelektrophorese zur Identifizierung LA-induzierter Proteine.

4. Diskussion: Interpretation der Ergebnisse hinsichtlich der Stoffwechselwege von Lävulinsäure, der Rolle von Ler und möglicher alternativer Abbauwege bei R. eutropha.

5. Zusammenfassung: Zentrale Erkenntnisse der Arbeit, einschließlich der Identifizierung LA-spezifischer Proteine und der Schlussfolgerung zur Funktion des Ler-Proteins.

6. Literatur: Verzeichnis der zitierten wissenschaftlichen Quellen.

Schlüsselwörter

Ralstonia eutropha, Lävulinsäure, Polyhydroxyfettsäuren, Lävulinat-Reduktase, Ler, Stoffwechselweg, 2-D-Gelelektrophorese, Biopolymere, 4-Hydroxyvaleriansäure, Stoffwechselanalytik, Proteinexpression, Gen-Disruption, Stoffwechselinduktion.

Häufig gestellte Fragen

Worum geht es in dieser Diplomarbeit grundsätzlich?

Die Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung des Lävulinsäurestoffwechsels im Bakterium Ralstonia eutropha HF39, um den Abbauweg dieses Substrats zu 4-Hydroxyvaleriansäure zu klären.

Welche zentralen Themenfelder werden bearbeitet?

Die Arbeit umfasst die Identifizierung des Ler-Proteins, die molekulargenetische Mutagenese, die enzymatische Charakterisierung im In-vitro-Test sowie die Proteomanalyse mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese.

Was ist das primäre Ziel der Arbeit?

Das primäre Ziel war die Verifizierung der Hypothese, dass das bei LA-Wachstum spezifisch gebildete Ler-Protein eine Lävulinatreduktase ist, die LA direkt zu 4-Hydroxyvaleriansäure reduziert.

Welche wissenschaftlichen Methoden kommen zum Einsatz?

Verwendet werden klassische mikrobiologische Methoden, molekularbiologische Techniken (Klonierung, PCR, Transformation, Konjugation), biochemische Enzymtests, Gaschromatographie zur Substratanalyse sowie die zweidimensionale Proteinelektrophorese inklusive Massenspektrometrie.

Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?

Der Hauptteil gliedert sich in eine detaillierte methodische Beschreibung sowie die Darstellung und Diskussion der Ergebnisse zur Gen-Analyse, zur Mutanten-Konstruktion und zu den durchgeführten Enzymtests.

Welche Schlüsselbegriffe charakterisieren die Forschungsarbeit?

Wichtige Begriffe sind Ralstonia eutropha, Lävulinsäure (LA), Lävulinatreduktase (Ler), 4-Hydroxyvaleriansäure (4HV), Biopolymer-Synthese, Stoffwechselregulation und Protein-Induktion.

Wurde durch die Deletion des ler-Gens der LA-Abbau vollständig blockiert?

Nein, die Deletion des ler-Gens hatte keine signifikanten Auswirkungen auf das Wachstum von R. eutropha auf Lävulinsäure, was darauf hindeutet, dass das Ler-Protein kein entscheidendes Schlüsselenzym für den primären LA-Abbauweg ist.

Welche Bedeutung kommt dem Methylcitratzyklus zu?

Die Arbeit identifizierte Methylcitrat-Lyase und Methylcitrat-Synthase als LA-induzierte Proteine, was die Beteiligung des Methylcitratzyklus am Abbau von Lävulinsäure untermauert.

Konnte Ler als LA-Reduktase in vitro bestätigt werden?

Nein, weder mit Lävulinsäure noch mit dem entsprechenden CoA-Thioester konnte eine signifikante enzymatische Reduktaseaktivität nachgewiesen werden, die eine direkte Funktion von Ler als Lävulinatreduktase belegen würde.

Welche alternative Theorie wird in der Diskussion vorgeschlagen?

Es wird diskutiert, dass Lävulinsäure unter normalen Bedingungen möglicherweise über alternative Wege abgebaut wird und 4HV lediglich ein bei Stressbedingungen gebildetes Auslagerungsprodukt zur Entgiftung und Speicherung darstellt.