Hemmung der Expression von porzinen endogenen Retroviren (PERVs) mittels RNA-Interferenz

Inhaltsverzeichnis

• Einleitung
• Xenotransplantation
• Mangel an Allotransplantaten
• Alternativen zur Allotransplantation
• Risiken der Xenotransplantation
• Immunologische Abstoßungsreaktionen
• Physiologische Inkompatibilität
• Potentielle Übertragung von porzinen Mikroorganismen
• Retroviren
• Taxonomie der Retroviren
• Morphologie der Retroviren
• Retrovirale Genomstruktur
• Retrovirale Replikation
• Porzine endogene Retroviren (PERVs)
• RNA-Interferenz
• Zielsetzung
• Material und Methoden
• Material
• Bakterienstämme
• Enzyme
• Oligonukleotide
• Plasmide
• Antikörper
• Eukaryotische Zellen
• Versuchstiere
• Nährmedien und Lösungen
• Kommerzielle Kits
• Hersteller
• Methoden
• Mikrobiologische Methoden
• Stammhaltung von Bakterien
• Kultivierung von Bakterien
• Herstellung kompetenter Bakterien und Transformation durch Hitzeschock
• Molekularbiologische Methoden
• Isolierung von Plasmid-DNA
• Isolierung genomischer DNA aus eukaryotischen Zellen
• Phenol-Chloroform-Extraktion
• Isolierung von Gesamt-RNA aus eukaryotischen Zellen
• Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
• Restriktion von DNA
• Ligation von DNA-Fragmenten
• Agarosegelelektrophorese
• Gelextraktion linearer DNA-Fragmente
• PCR (Polymerase Chain Reaction)
• one-step RT (Reverse Transcriptase) PCR
• one-step RT (Reverse Transcriptase) real-time PCR
• DNA-Sequenzierung
• Proteinchemische Methoden
• Isolierung von Gesamtprotein aus eukaryotischen Zellen
• Bestimmung der Proteinkonzentration
• SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE)
• Western Blot-Analyse
• Zellbiologische Methoden
• Kultivierung eukaryotischer Zellen
• Kryokonservierung eukaryotischer Zellen
• Zellzählung und Vitalitätsbestimmung mit Trypanblau
• Transfektion eukaryotischer Zellen mit Plasmid-DNA
• Ergebnisse
• Hemmung der PERV-Expression in Fibroblasten Pol2-shRNA-transgener Schweine
• Generierung shRNA-transgener Schweine mittels Nukleus-Transfer
• Nachweis der Transgen-Integration mittels Fluoreszenz
• Nachweis der Transgen-Integration mittels PCR
• Etablierung einer one-step RT real-time PCR zur Quantifizierung der PERV-mRNA
• Qualitativer Nachweis von PERV in primären Fibroblasten transgener Schweine
• Quantitativer Nachweis der PERV-Expression in primären Fibroblasten transgener Schweine
• Hemmung der PERV-Expression in PK15- und PERV-A/C infizierten 293-Zellen mittels neu synthetisierter shRNAs
• Selektion eines PERV-A/C infizierten 293-Klons zur Generierung einer Zelllinie mit gleicher Provirusintegration
• Generierung und Klonierung neuer Expressionskassetten für PERV-spezifische-shRNAs
• Stabile Transfektion von PK15- und PERV-A/C-infizierten 293-Zellen mit shRNA-Expressionskassetten
• Nachweis der shRNA-Expressionskassetten in PK15- und PERV-A/C-infizierten 293-Zellen

Zielsetzung und Themenschwerpunkte

Die vorliegende Diplomarbeit beschäftigt sich mit der Hemmung der Expression von porzinen endogenen Retroviren (PERVs) mittels RNA-Interferenz. Ziel ist es, neue Ansätze zur Reduktion des PERV-Risikos in der Xenotransplantation zu entwickeln.

• Xenotransplantation und ihre Risiken, insbesondere die Übertragung von PERVs
• Die Funktionsweise von RNA-Interferenz und ihre Anwendung in der PERV-Hemmung
• Die Entwicklung und Validierung von shRNA-Expressionskassetten zur gezielten PERV-Silencing
• Die Untersuchung der Effektivität der shRNA-vermittelten PERV-Hemmung in verschiedenen Zellmodellen
• Die potentielle Anwendung der Ergebnisse für die zukünftige Entwicklung von PERV-resistenten Spenderorganen

Zusammenfassung der Kapitel

Die Einleitung gibt einen Überblick über die Xenotransplantation, ihre Risiken und die Rolle von PERVs in diesem Kontext. Die RNA-Interferenz als potenzielles Werkzeug zur PERV-Hemmung wird vorgestellt und die Zielsetzung der Arbeit erläutert.

Das Kapitel "Material und Methoden" beschreibt die verwendeten Materialien, inklusive Bakterienstämme, Enzyme, Oligonukleotide, Plasmide, Antikörper, eukaryotische Zellen, Versuchstiere, Nährmedien und Lösungen. Die wichtigsten molekularbiologischen und zellbiologischen Methoden werden detailliert dargestellt.

Die Ergebnisse der Arbeit werden im Kapitel "Ergebnisse" präsentiert. Es werden die Ergebnisse der Generierung shRNA-transgener Schweine, die Validierung der shRNA-Expressionskassetten und die Untersuchung der PERV-Hemmung in verschiedenen Zellmodellen dargestellt.

Schlüsselwörter

Xenotransplantation, porzine endogene Retroviren (PERVs), RNA-Interferenz, shRNA, PERV-Hemmung, Zellkultur, Transfektion, PCR, real-time PCR, Western Blot

Häufig gestellte Fragen

Was sind porzine endogene Retroviren (PERVs)?

PERVs sind Viren, die fest im Genom von Schweinen integriert sind. Sie stellen ein Risiko bei der Xenotransplantation dar, da sie menschliche Zellen infizieren könnten.

Wie kann RNA-Interferenz das Infektionsrisiko senken?

RNA-Interferenz kann die Replikation von PERVs posttranskriptional unterbinden, indem spezifische shRNAs die Virus-mRNA gezielt abbauen oder blockieren.

Welche Erfolge wurden bei transgenen Schweinen erzielt?

Es gelang, transgene Schweine zu züchten, die shRNAs stabil exprimieren. In deren Fibroblasten konnte die PERV-Expression um bis zu 93 % reduziert werden.

Warum reicht eine keimfreie (DPF) Zucht nicht aus?

Da PERVs endogen, also fester Bestandteil des Erbguts sind, lassen sie sich nicht durch äußere Hygienemaßnahmen oder herkömmliche Zuchtmethoden eliminieren.

Welche molekularbiologischen Methoden wurden zur Überprüfung genutzt?

Zur Quantifizierung und zum Nachweis wurden moderne Verfahren wie die one-step RT real-time PCR, Western Blot-Analysen und Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt.