II. Abbildungsverzeichnis
III. Tabellenverzeichnis
IV. Abkürzungsverzeichnis
1. Einleitung
2. Typ-1-Diabetes (T1D)
2.1. Historie, Verbreitung & Nomenklatur des Diabetes mellitus
2.2. Krankheitsbild & Diagnose des T1D
2.2.1. In vivo-Modelle von T1D
2.3. Ätiologie und Pathogenese des T1D
3. Einführung in die Stammzellforschung
4. Mesenchymale Stroma-/Stammzellen (MSC)
4.1. In vitro
4.2. In vivo
5. Immunmodulation mit MSC
5.1. Immunogenität von MSC selbst
5.2. MSC und Antigen-präsentierende Zellen (APC)
5.2.1. MSC und B-Zellen
5.2.2. MSC und Makrophagen
5.2.3. MSC und dendritische Zellen (DC)
5.3. MSC und T-Zellen
5.3.1. MSC und regulatorische T-Zellen
5.3.2. MSC und T-Helferzellen / cytotoxische T-Zellen
5.4. MSC und natürliche Killerzellen
5.5. MSC und neutrophile Granulozyten
5.6. MSC und lösliche Faktoren
6. In vivo - Potential von MSC in T1D und Autoimmunerkrankungen
7. Diskussion
8. Zusammenfassung
9. Literaturverzeichnis
10. Anhang
Abb. 1: Inzidenz von diagnostiziertem Diabetes bei Menschen unter 20 Jahren, USA, 2002 bis 2003 [http://diabetes.niddk.nih.gov/dmpubs/statistics/ #d_ allages, Stand 10/2009]
Abb. 2: Stadien beim Verlust der ß-Zellmasse bei Fortschreiten von T1D, [modifiziert nach Eisenbarth, 1986]
Abb. 3: Autoimmungeschehen bei T1D, eigene Darstellung
Abb. 4: Zelluläre Mechanismen des ß-Zelltodes [Mathis et al., 2001]
Abb. 5: Diabetesprogression von Verwandten ersten Grades bereits erkrankter T1D-Patienten, unterteilt nach Anzahl exprimierter AK [adaptiert nach Verge et al., 1996]
Abb. 6: Entwicklung humaner Gewebe aus einer Zygote [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/ primer/genetics_cell.html, Stand 10/2009]
Abb. 7: Prinzip der Trans- und Dedifferenzierung von SC am Beispiel von SC des CNS [Weissmann, 2000]
Abb. 8: Darstellung der Unterschiede zwischen SC und PC [auf Basis von NIH, 2001 - online]
Abb. 9: Entwicklungswege aus einer MSC [Caplan, 2009]
Abb. 10: Der Anteil humaner MSC an monozytären KM-Zellen nimmt mit dem Alter ab [Caplan, 2009]
Abb. 11: Hypothetische Sicht der pDC und cDC-Entwicklung in der Maus zur beispielhaften Illustration der vermischten Differenzierungswege von DC und Makrophagen [Merad, 2007]
Abb. 12: Überblick über verschiedene Differenzierungswege und Reifungsprozesse von DC [Banchereau et al., 2000]
Abb. 13: Exemplarische Darstellung der unterschiedliche Entwicklungswege einer DC in Abhängigkeit der auf sie einwirkenden Stimuli [Pardoll et al., 2002]
Abb. 14: KIR-bedingte Hemmung der Zielzell-Lyse [http://www.fccc.edu/ research/reports/current/campbell.html, Stand 10/2009]
Abb. 15: Zusammenfassung der potentiellen Mechanismen, über die MSC nach momentanem Wissensstand in das Immungeschehen eingreifen können, eigene Darstellung.
Tbl. 1: 2006 von der ISCT festgelegte Kriterien zur Identifikation von MSC [Dominici et al., 2006]
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Die Immunmodulation inflammatorischer Autoimmunerkrankungen mit Hilfe mesenchymaler Stroma-/Stammzellen als potentielle Therapieform für Diabetes Typ 1 ist als Thema nicht nur epigraphisch eine Herausforderung.
T1D und Autoimmunerkrankungen allgemein sind Bereiche, in denen das Wissen um die Ursachen noch sehr begrenzt ist; und Stammzellen, die mesenchymalen im Speziellen, sind ein Kapitel der Wissenschaft, in dem man gerade erst zu schreiben begonnen hat. Dies kann man buchstäblich daran ablesen, dass noch nicht einmal der Name für diese Zellart eindeutig feststeht.
Mit dieser Arbeit soll der Versuch gemacht werden, die Erkenntnisse beider Themenbereiche produktiv miteinander zu verknüpfen und weiterzuführen. Die dabei auf Grundlage des aktuellen Wissenstandes aufgestellten Hypothesen können möglicherweise Anstöße für weitere Denkmodelle bzw. Versuchsreihen liefern, die die hier dargestellten Perspektiven bestätigen. Die Arbeit konzentriert sich dabei auf die Immunmodulation in Bezug auf die Krankheitsentwicklung und ihre Umkehrung. Immunmodulation im Rahmen von Pankreas-/Inselzell-Transplantationen wird hier nicht behandelt, da diese keine kausale Therapie, sondern nur eine Beseitigung der Symptome zum Ziel hat.
Zunächst wird in Kapitel 2 die Grundlage für ein tieferes Verständnis der Diabeteserkrankung gelegt. Kapitel 2.1 setzt Diabetes nicht nur historisch, sondern v.a. im Bezug auf Bedeutsamkeit und begriffliche Abgrenzung in einen Kontext.
In Kapitel 2.2 werden Krankheitsbild und Diagnose von T1D kurz zusammengefasst, mit einem Exkurs zu weiteren in vivo-Modellen neben dem menschlichen, die sich später in T1D- wie MSC-relevanten Studien wiederfinden.
Unter Ätiologie und Pathogenese von T1D wird in Kapitel 2.3 u.a. eine Auswahl der aktuellen Theorien zur Entstehung dieser Krankheit vorgestellt und, soweit der Rahmen dieser Arbeit es erlaubt, zusammen mit den immunologischen Grundlagen möglichst ausführlich beschrieben. Denn nur ein detailliertes Verständnis dieser Mechanismen ermöglicht es im Weiteren die potentiellen Ansatzpunkte für MSC zu erkennen.
Mit Kapitel 3 erfolgt ein Schnitt, nach dem die Stammzellen thematisiert werden. Auch hier werden zunächst die Grundlagen dargestellt, indem der Kontext der MSC – die Stammzellforschung – umrissen und die nachfolgende Nomenklatur festgelegt wird, die in diesem Fachbereich nicht immer einheitlich gebraucht wird.
Die MSC und ihre Eigenschaften werden in Kapitel 4 genauer beschrieben, unterteilt in Erkenntnisse aus in vitro- und in vivo-Untersuchungen. Hier wird auch das Dilemma um die Benennung dieser Zellart erklärt. Um diesem Rechnung zu tragen, wird in dieser Arbeit sowohl der Begriff Stroma- wie Stammzelle bzw. die neutrale Abkürzung MSC verwendet.
Kapitel 5 schließlich ist speziell der Immunmodulation mit MSC gewidmet. Um Ordnung in die stark interdependente Materie der Immunregulation zu bringen, wurde die Aufteilung nach den wichtigsten Immunzelltypen gewählt. Diese Kapitel sind besonders komplex: Zum einen auf Grund der unüberschaubaren Wechselwirkungen einer Vielzahl an Faktoren im Immunsystem. Zum anderen wird die Einordnung durch die äußerst widersprüchlichen Studienergebnisse und die Diversität der Untersuchungsansätze im Bereich der MSC erschwert. Um eine möglichst große Vernetzung herstellen zu können, werden daher die Anknüpfungspunkte für eine T1D-Therapie in die Beschreibung der MSC-Interaktionen eingeflochten. Im Unterkapitel 5.6 sind zuletzt die löslichen Faktoren, die in diesem Geschehen wirken, noch einmal gesondert herausgegriffen, um so noch einmal eine fokussiertere Betrachtung zu ermöglichen und gleichzeitig die Vielfalt ihrer Wirkmechanismen im Wechselspiel mit MSC darstellen zu können.
Im 6. Kapitel wird die in vivo-Studienlage im Bezug auf MSC-Therapie bei T1D beleuchtet, weil es ja letztendlich primär um das Auffinden einer Therapie für den Menschen geht. Da diese, speziell in Hinblick auf Humanstudien, sehr dürftig ist, werden Erkenntnisse aus verwandten Autoimmun-Szenarien zu Rate gezogen, um eine zum momentanen Zeitpunkt bestmögliche Einordnung der MSC als Therapieform zu erlauben.
Die Diskussion enthält einerseits einen optimistischen Blick in die Zukunft, mit der auf dem momentanen Kenntnisstand gegründeten Vision einer T1D-Therapie mit MSC, auf die einige Studien, insbesondere im Kontrast zu heutigen Therapiemethoden, hoffen lassen. Andererseits werden kritisch die Risiken beleuchtet, die im Bezug auf ein so junges und unstandardisiertes Forschungsfeld bestehen, und wichtige Aspekte für die weitergehende Forschung aufgezeigt.
Historie
Diabetes mellitus ist ein der Menschheit seit langem bekanntes Krankheitsbild. Die erste Erwähnung findet sich bereits 1552 v. Chr. bei einem ägyptischen Gelehrten namens Hesy-Ra zusammen mit Arzneien, die den „Verlust von zu viel Urin“ verhindern sollen.
Der Name „diabetes mellitus“ ist ein griechisch-lateinischer Mischterminus und heißt übersetzt so viel wie „honigsüßer Durchfluss“. Obwohl er 1769 von dem Briten William Cullen eingeführt wurde, war die Krankheit bereits dem Griechen Hippokrates im 4. Jahrhundert v. Chr. vertraut. Auch in vielen anderen Kulturen wie in der chinesischen und sogar bei den Indianerstämmen Südamerikas findet dieses Bild des „süßen Urins“ Eingang in die Anamnese von Kranken.
Der Brite Willis vermutete 1664 hier nicht eine primäre Erkrankung der Nieren, sondern des Blutes und Dopson konnte 1776 aus dem Urin von Diabetes-Kranken sogar eine weißliche Substanz gewinnen, die er als "brüchig und kaum von Zucker zu unterscheiden" beschrieb.
1869 lokalisiert der deutsche Medizinstudent Paul Langerhans die Inselzellen des Pankreas, kann ihre Funktion jedoch nicht erklären - seinen Namen tragen sie seitdem trotzdem. [http://www.diabetesgate.de/diabetes/2004/aegypter.php, Stand 10/2009]
Zu Beginn des 20. Jahrhunderts entdeckte der amerikanische Pathologe Eugene Opie einen Zusammenhang zwischen den pankreatischen Langerhans-Inseln und dem Auftreten von Diabetes und legte so den Grundstein für weitere ursachengerichtete Forschung. In den 20er Jahren trugen insbesondere Banting und MacLoad entscheidend zur Entdeckung des Insulins, seiner ersten Extraktion aus Kälberpankreas und damit zur Diabetesbehandlung bei. Hierfür erhielten sie 1923 den Nobelpreis. [http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/, Stand 10/2009]
Noch in den 50er Jahren starb jeder fünfte Diabetiker innerhalb der ersten 20 Jahre nach Diagnosestellung [NIH, 2001 - online]. 1966 glückte dann an der University of Manitoba (Kanada) die erste Pankreastransplantation. Schließlich gelang 1982 der wahrscheinlich berühmteste Erfolg im “genetic engineering”: Auf Basis von Sangers Arbeiten über Struktur und Sequenz von Insulin entwickelte die Pharmafirma Eli Lilly mit Hilfe rekombinanter DNA-Technologie das erste biosynthetische Human-Insulin. Seitdem konnte Human-Insulin in die Massenproduktion gehen und stellt so eine sehr viel reinere und wertvollerer Insulinquelle dar, als die zuvor genutzten tierischen Pankreasextrakte. [http://www.diabetes.ca/Section_About /timeline.asp, Stand 10/2009]
Auch bis dato sind eine gut eingestellte Insulinmedikation sowie die Pankreas- bzw. Inselzell-Transplantation die einzigen allgemein anerkannten und in größerem Umfang praktizierten Therapiemöglichkeiten bei Diabetes Typ 1, obwohl alternative Therapieformen immer nötiger und lukrativer werden. [Lüddeke et al., 2002]
Prävalenz & Inzidenz
Diabetes wird von der WHO als „Epidemie des neuen Jahrtausends“ bezeichnet und verursacht nach Schätzungen weltweit Kosten von über 280 Mill. US $ pro Jahr [http://www.eatlas.idf.org/Costs_of_diabetes/, Stand 10/2009]. Auch wenn sich das Hauptaugenmerk zum Großteil auf T2D richtet - mit über 246 Mio. Fällen weltweit [WHO, 2008], nach Schätzungen des DDZ 2005 davon allein über 7 Mio. in Deutschland, ist T1D nicht zu unterschätzen.
Abhängig von Land und Studie geht man davon aus, dass ca. 10% der Diabetesfälle zum Typ 1 gerechnet werden können [Zimmet et al., 2001].
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Abb. 1: Inzidenz von diagnostiziertem Diabetes bei Menschen unter 20 Jahren, USA, 2002 bis 2003 [http://diabetes.niddk.nih.gov/dmpubs/statistics/ #d_ allages, Stand 10/2009]
Die T1D-Fälle pro 100.000 Personen / Jahr (dunkelblau) wurden in Relation gesetzt zu den T2D-Fällen (hellblau) in den Altersklassen < 10 Jahre und zwischen 10 -19 Jahren, unterteilt nach ethnischer Herkunft.
NHW = Weiße nicht spanischer Abstammung; AA = Afrikanische Amerikaner; H = Amerikaner spanischer Abstammung; API = Asiatische / Pazifische Insulaner; AI = Amerikanische Inder
Nach Angaben der IDF für Deutschland lag die Inzidenz im Jahr 2003 bei 12,2 Fällen / 100.000 Personen pro Jahr. Und ebenso wie beim Typ 2 ist hier im Zeitverlauf der globalen Inzidenz eine Steigerung von aktuell 3% zu erkennen. Schätzungen prognostizieren somit, dass die T1D-Inzidenz 2010 um 40% höher sein wird als 1998 [Gillespie, 2006].
Beobachtungsstudien in Deutschland ergaben für die Altersgruppe bis 14 Jahre ähnliche Werte, nämlich einen mittleren jährlichen Inzidenz-Anstieg von 3,8 %. Verglichen mit den ersten Jahren der Erfassung entsprach der Anstieg einer Verdoppelung von neuen T1D-Fällen (1987–1989, n = 153; 2000–2003, n = 302), wobei die höchste Steigerung in der jüngsten Altersgruppe (0-4 Jahre) zu finden war. [Neu et al., 2001, Ehehalt et al., 2008]
Dass die Inzidenz-Angaben weltweit so gut mit denen für Deutschland übereinstimmen, ist durchaus nicht selbstverständlich, da die Zahl der Neuerkrankungen von Land zu Land sehr unterschiedlich sein kann. Vergleicht man die Daten von 1994, findet man Abweichungen von teilweise fast 100%, beispielsweise zwischen China (0,7 / 100.000) oder Venezuela (0,1 / 100.000) und Finnland mit 36,5 Fällen / 100.000 Personen. [Karvonen et al., 2000]
Dies kann auf genetische Unterschiede zwischen den einzelnen Populationen zurückzuführen sein. Weil die Inzidenz in den letzten Jahren aber kontinuierlich angestiegen ist, müssen auch Umwelteinflüsse, wie z.B. Änderungen der traditionellen Ernährungsweisen, zu einem nicht unerheblichen Maße dafür verantwortlich sein, da der Genpool sich so schnell nicht verändern kann.
Damit sind die Zahlen für Typ 1 zwar nicht so dramatisch wie für Typ 2, trotz allem ist der Großteil der Diabetiker unter 14 Jahren noch immer Typ-1-Diabetiker (S. Abb. 1).
Ebenfalls zu berücksichtigen ist, dass viele Therapieansätze, die für Typ 1 gefunden werden auch für Typ 2, insbesondere im fortgeschrittenen Stadium, anwendbar sind. Außerdem sind beide Diabetestypen auf Grund des schlecht regulierten Insulins bzw. Blutzuckers mit erheblichen Komplikationen und Folgeerkrankungen assoziiert, so dass eine Therapiemöglichkeit sowohl ethisch als auch monetär lohnend wäre.
Die Nomenklatur und die Einteilung der Diabetesformen in ihre einzelnen Untergruppen wurde 1997 von der „American Diabetes Association“ (ADA) überholt und weltweit von anderen angesehen Organisationen wie der „Deutschen Diabetes Gesellschaft“ (DDG) übernommen. Die Zuordnung erfolgt auf Grund der angenommen Ursachen [ADA ,1997]:
1. Typ-1-Diabetes mellitus: Zerstörung der Inselzellen des Pankreas führt üblicherweise zu absolutem Insulinmangel
Typ 1a: immunvermittelt (Autoimmunerkrankung)
Typ 1b: idiopathisch (ungeklärte Pathogenese)
2. Typ-2-Diabetes mellitus: Unterschiedliche Kombinationen von Insulinresistenz, Hyperinsulinismus, relativem Insulinmangel, Sekretionsstörungen
3. Gestationsdiabetes
4. Andere spezifische Diabetes-Typen
Außerdem wird ein Diabetes Typ 1 häufig synonym verwendet mit:
- Jugenddiabetes: = juveniler Diabetes mellitus ist die veraltete Bezeichnung für T1D, da dieser v.a. in jungen Jahren auftritt. Dies ist jedoch nicht zwingend (s. LADA) und daher keine adäquate Bezeichnung.
- LADA = latent autoimmune diabetes with onset in adults. Diabetesform, die dem Diabetes Typ 1a zugeordnet wird, d.h. bei der Auto-AK nachweisbar sind. Im Gegensatz zu T1D, der sich v.a. bei Kindern und Jugendlichen manifestiert, bezeichnet LADA eine Form, die zu jeder Zeit im Erwachsenenalter auftreten kann.
- IDDM: = insulin dependent diabetes mellitus. Klassifizierung nach der notwendigen Therapieform. Problematisch ist hier, dass sie zwar v.a. auf Typ 1 zutrifft – jedoch nicht ausschließlich. Daher ist der Gebrauch des Terminus seit 1997 eigentlich überholt, dennoch ist er noch häufig zu finden.
Der immunvermittelte Diabetes Typ 1a steht auf Grund seiner stärkeren Verbreitung gegenüber Typ 1b, vor allem aber der potentiell immunmodulierenden Eigenschaften von MSC, bei dieser Arbeit klar im Vordergrund. Da aber auch hier die Pathogenese nicht vollständig geklärt ist (s. Kap. 2.3), kann es durchaus bisher unbekannte Überlappungen mit Typ 1b geben. Diese Fälle, die eine T1D-Erkrankung ohne AK-Nachweis darstellen, sind wegen ihrer nebulösen Entstehung schwerlich in die Therapieüberlegungen einzubeziehen und können in Studien am lebenden Objekt durch abweichende Ergebnisse leicht zu Verwirrungen und Fehlschlüssen führen.
Das Krankheitsbild des Diabetes mellitus bezeichnet eine chronische Hyperglykämie, die in Störungen anderer Stoffwechselprozesse, bis hin zu Organschäden, resultiert. [Roche Lexikon Medizin, 2003]
Da die wesentlichen biochemischen Grundlagen, die die Symptomatik dieser Krankheit bestimmen, bei der Lektüre dieser Arbeit als bekannt vorausgesetzt werden, soll sich die Beschreibung in diesem Kapitel auf Kernpunkte beschränken.
Durch die idiopathische oder autoimmunbasierte Dezimierung der ß-Zellen des Pankreas (s. Kap. 2.1) steht dem Körper nicht mehr ausreichend Insulin zur Verfügung, um z.B. über die GLUT-Translokation die Zellen mit der im Blut zirkulierenden Glucose zu versorgen.
So kommt es zu Hyperglykämie und ihren vielfältigen nachteiligen Auswirkungen. Hierzu zählen vor allem Gefäßschäden, Begünstigung entzündlicher Prozesse und radikalischer Schädigungen, sowie allgemein das Einschlagen in diesem Maße unphysiologischer Stoffwechselwege wie z.B. Hexosamin-, AGE-, Polyol-, PKC-Weg. Ebenso wie dysregulierte Apoptose, Proteinsynthese, Proliferation und Differenzierung der Körperzellen eine Folge dessen sein können. [Brownlee, 2001]
Gleichzeitig, bzw. diese Prozesse teilweise unterstützend, leiden die Insulin-abhängigen Gewebe durch den unzureichenden Einstrom an einer Glucoseunterversorgung. Dadurch bleiben Energie bereitstellende Stoffwechselwege wie Gluconeogenese, Glykogenolyse und Lipolyse aktiv und sorgen in der Konsequenz für einen noch weiter erhöhten Blutzuckerspiegel. [Saltiel et al., 2001]
Wenn dieser die Nierenschwelle von ca. 180 mg/dl überschreitet, wird die Resorptionsfähigkeit der Niere derart überfordert, dass neben der Glucosurie eine Polyurie eintritt, deren Folge Polydipsie bzw. Exsikkose und Nährstoffverlust sein können. [Biesalski Ernährungsmedizin, 2004]
Zusätzlich entstehen durch die stimulierte Lipolyse, in Kombination mit einem Substratmangel im Citratzyklus durch die Glucoseverknappung, vermehrt Ketonkörper, die zu einer Ketoacidose führen können.
Da es sich bei dem Typ-1-Diabetes im Endstadium im Gegensatz zu Typ 2 um einen absoluten Insulinmangel handelt, können die Zustände der Glucosedeprivation in den abhängigen Geweben, wie dem Gehirn, zu dramatischen Konsequenzen wie dem diabetischen Koma bis hin zum Tode führen. [Biesalski Ernährungsmedizin, 2004]
Folgeerkrankungen sind v.a. durch Gefäßveränderungen (Mikro- u. Makroangiopathie) bedingt. Ihre Ausprägung hängt vom Alter bei Erstmanifestation, von der Dauer der Erkrankung, Qualität der Stoffwechseleinstellung und den Begleiterkrankungen ab. An erster Stelle steht die diabetische Retinopathie bis zur Erblindung, weitere Folgen sind die Nephropathie bis hin zur Niereninsuffizienz, die Neuropathie, das diabetische Fußsyndrom und kardiovaskuläre Komplikationen. [Roche Lexikon Medizin, 2003]
Daher darf ein T1D nicht unentdeckt bleiben. Die ersten klinischen Symptome treten jedoch erst auf, wenn bereits bis zu 80% der ß-Zellen zerstört sind [Kukreja et al., 1999] (S. Abb. 2).
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb. 2: Stadien beim Verlust der ß-Zellmasse bei Fortschreiten von T1D, [modifiziert nach Eisenbarth, 1986]
Die ab Geburt gegebene ß-Zellmasse tritt, ggf. durch genetische Präsdisposition oder ein plötzliches Ereignis ausgelöst, in den diabetogenen Prozess ein. Obwohl ab hier immunologisch nachweisbar, kann die reduzierte Insulinsekretion zunächst kompensiert werden und so bleibt auch der Blutglucosespiegel normal und die Erkrankung häufig unerkannt. Die ß-Zellmasse verringert sich weiter und erst wenn sie bereits zum Großteil zerstört ist, ist die T1D-Erkrankung offensichtlich und schreitet fort bis schließlich auch das C-Peptid ebenso wie die ß-Zellmasse komplett verschwunden ist.
Eine Diagnose kann sich auf mehrere Analysewerte stützen. Grundsätzlich ist hier zu unterscheiden, welche Verfahren zur Diagnose eines Diabetes allgemein und welche zur Diagnose eines T1D taugen.
Zur allgemeinen Diabetes-Diagnose:
Sie erfolgt zum einen auf Grund erhöhter Blutzucker-Werte. Zusätzlich hilfreich ist der HbA1c-Wert, der Aufschluss über das glycosylierte Hämoglobin im Blut und damit den Blutzuckerspiegel in einem Zeitraum von ca. 3 Monaten gibt. Dieser Wert ist umso höher, je höher der Blutzucker in diesem Zeitraum war. Beim Diabetiker liegt der HbA1c-Wert über dem Normalwert von 4,5 – 6,5%. [Aventis Patientenbroschüre, 2008 - online]
Zu den sonstigen Anzeichen für Diabetes, die allein für eine Diabetes-Diagnose jedoch nicht hinreichend sind, zählen z.B. Glucosurie, Ketoacidose, Polydipsie, Gewichtsverlust etc. [Roche Lexikon Medizin, 2003]
Zur speziellen T1D-Diagnose:
Das C-Peptid verbindet im Proinsulin-Molekül die A- mit der B-Kette und wird bei der Umwandlung in aktives Insulin abgespalten. Damit ist es proportional zur Insulinsekretion und hat gleichzeitig den Vorteil, dass seine Halbwertszeit länger ist als die des Insulins. Bei einem Insulinmangeldiabetes wie T1D wäre damit das C-Peptid erniedrigt, während es bei T2D erhöht ist. [Roche Lexikon Medizin, 2003]
Beim Diabetes Typ 1a, jedoch nicht beim idiopathischen Typ 1b, ist der Nachweis von Autoantikörpern eine wichtige Methode. Autoantikörper können in ca. 75% aller T1D Fälle nachgewiesen werden [Hummel et al., 2004]. Diese werden je nach Zielantigen in verschiedene Autoantikörper differenziert. Die wichtigsten sind v.a. GADA (Glutamatdecarboxylase-AK), IAA (Insulin-Auto-AK) und AK gegen IA-2 (Insulinoma assoziertes AG). Auf diese wird noch genauer in Kapitel 2.3 eingegangen.
Außerdem hat sich herausgestellt, dass T1D häufig mit bestimmten HLA- bzw. MHC-Typen assoziiert ist, weswegen auch eine HLA-Typisierung einen Weg der Diagnose bzw. Risikobestimmung darstellt, die sogar bereits in utero durchgeführt werden kann. [Giannoukakis et al., 1999]
Diabetes bzw. Insulitis kann bei verschiedenen Tierarten induziert werden. Dies setzt entweder bestimmte Mutationen in der entsprechenden Population voraus oder wird durch bestimmte Pharmaka ausgelöst.
Hierzu zählen Alloxan und verschiedene Steroide, v.a. aber STZ (Streptozotocin), das in hohen Dosen direkt Diabetes induziert, während niedrige Dosen eine Art chronischen Diabetes-Verlauf zur Folge haben. Die selektive Wirkung auf ß-Zellen erklärt sich aus der Strukturverwandtschaft mit Glucose, die durch GLUT2, jedoch nicht von anderen GLUT-Varianten, in die ß-Zelle transportiert wird. Dort wird Methylnitrosoharnstoff abgespalten, der für die DNA-schädigenden Wirkungen verantwortlich ist.
Das mit Abstand am weitesten verbreitete Versuchstier zur Untersuchung von T1D ist neben der BB-Ratte die NOD-Maus (Non Obese Diabetic-Maus). Sie wurde erstmals in den 1970er Jahren in Japan beschrieben und hat Mutationen in MHC-Genen (Fehlen von I-E, abnormales I-Ag7), deren Pendants auch bei Menschen mit T1D in einem signifikant erhöhtem Maße verändert sind (s. Kap. 2.3). Sowohl bei Mensch wie Maus tragen aber noch viele andere Genloci zur T1D-Entwicklung bei - es handelt sich bei T1D also um eine polygene Erkrankung. [W.Tb. of Endocrinology, 2008]
Ähnlich wie beim Menschen zeigt die NOD-Maus im Alter von 3 - 4 Wochen eine Insulitis mit Infiltraton der ß-Zellen, auf die eine Zerstörung derselben folgt [Atkinson et al., 1994]. Auch sie weist vor der Manifestation Auto-AK auf [Yu et al., 2000]. Als Sonderform der NOD-Maus wird auch die NOD-SCID-Maus (Non Obese Diabetic - Severe Combined Immunodeficiency-Maus) verwendet, die keine T- und B-Lymphozyten besitzt [Wong et al., 1996]
T1D konnte in der NOD-Maus bereits auf über 100 verschiedenen Wegen geheilt oder verhindert werden [Roep et al., 2004]. Doch wie sich am Beispiel Nicotinamid sehr schön zeigt, sind diese Ergebnisse meist nicht 1:1 auf den Menschen übertragbar (s. ENDIT in Kap. 2.3). Ein weiterer Unterschied zum Menschen ist, dass die Prävalenz bei weiblichen Subjekten sehr viel höher ist als bei männlichen und dass diese Mäuse in einer apathogenen Umgebung gehalten werden müssen. [W.Tb. of Endocrinology, 2008]
Trotzdem stellt das NOD-Mausmodell eines der T1D-Entwicklung beim Menschen ähnlichsten Untersuchungsmodelle dar und wird im weiteren Verlauf dieser Arbeit noch häufig auftauchen.
Obwohl T1D seit vielen Jahrzehnten Gegenstand intensiver Forschung ist, sind bis heute weder die Induktoren noch der Ablauf des T1D hinreichend bekannt. Es ist nicht klar, ob die ß-Zellen direkt oder indirekt angegriffen werden, ob AG durch die lebende Zelle oder durch ihren Tod bzw. „AG-shedding“ zugänglich gemacht werden und warum andere Zellen überleben, obwohl sie dieselben AG besitzen oder sogar mit denselben inflammatorischen Mediatoren in Kontakt kommen wie die ß-Zellen. [Eisenbarth, 2008]
So ergeben sich aus teilweise widersprüchlichen Studienergebnissen verschiedene Theorien. Dies ist nicht zuletzt zurückzuführen auf die Hindernisse, auf die man bei der näheren Untersuchung der Krankheit stößt. Die ß-Zellen des Pankreas sind auf Grund ihrer Lokalisation schwer zu erreichen, so dass eine Biopsie um das Stadium der Krankheit zu bestimmen beim lebenden Patienten nahezu unmöglich ist [von Herrath, 2004]. Befunde können so nur durch Untersuchung bereits Verstorbener gewonnen werden - wobei es sich hier meist um Abbildungen des Endstadiums der Krankheit handelt - oder in vitro oder in Tierversuchen. Bei letzteren sind Versuche an NOD-Mäusen besonders wesentlich (s. Kap. 2.2.1).
Diese zeigen zwar deutliche T1D-Symptomatik, sind jedoch ein nur unvollkommenes Abbild der menschlichen Physiologie bzw. Pathogenese und sind daher mit Bedacht zu bewerten. Ähnliches gilt für analytische Methoden wie z.B. die T-Zell-Identifikation oder AK-Nachweise, die häufig in Bezug auf Sensitivität und Genauigkeit an ihre Grenzen stoßen oder schlichtweg mit heutigen Mitteln noch nicht möglich sind. [Talmage et al., 2008]
Im Krankheitsbild des T1D ist bei Mensch wie NOD-Maus histologisch eine monozytäre Rundzellinfiltration zu beobachten [Kelemen et al., 2004 - online]. Diese geht fließend über in Peri- bzw. Intra-Insulitis (Entzündung um die ß-Zellen herum bzw. in den Inseln des Pankreas), auf die dann nach Dysfunktion die komplette Destruktion der ß-Zellen folgt.
Die übermäßige Lymphozytenpräsenz legte es nahe, jene als Auslöser des T1D zu vermuten und näher zu untersuchen.
Die Analyse des Infiltrats ergab eine Dominanz von CTL und dazu passend eine erhöhte MHC1-Expression [Bottazo et al., 1985].
Aber nicht nur CTL scheinen wichtig zu sein: Th können ebenso ohne Hilfe von CTL T1D auslösen [Bradley et al., 1992], was wiederum passt zu der Beobachtung, dass das T1D-Risiko mit den MHC2-Genen assoziiert ist (s.u.).
Bei Versuchen an der NOD-Maus kann durch Lymphozytenübertragung T1D von einem erkrankten zu einem nicht erkrankten syngenen Tier übertragen werden. Hierzu ist jedoch die Übertragung sowohl von Th als auch CTL notwendig [Bendelac et al., 1987]. Bei der NOD-SCID-Maus kann jede Gruppe allein den T1D übertragen [Wong et al., 1996].
Ergebnisse von Kägi et al. 1999 zeigen, dass bei einer Blockierung des von CTL genutzten Perforin-Weges NOD-Mäuse teilweise vor T1D geschützt waren. Ein vollkommenes Ausbleiben der Krankheit wurde jedoch nur erreicht, wenn ebenfalls der TNF-Weg durch eine Rezeptor-Defizienz unterbunden wurde. Dies legt nahe, dass CTL ß-Zellen über Perforin-abhängige Cytotoxizität lysieren, während Th, Makrophagen und DC über den TNFR1-abhängigen Weg zur Diabetesentstehung beitragen. In diesem Zusammenhang gibt es aber auch andere Mechanismen, die sich toxisch auf die ß-Zellen auswirken (s.u.).
Sowohl CTL wie Th sind darauf angewiesen von APCs (wie Makrophagen, DC, und B-Zellen) auf adäquate Weise AG präsentiert zu bekommen, da sie andernfalls deletiert oder anergisch werden. Adäquat heißt in diesem Fall vor allem, dass zur Präsentation der AG costimulatorische Signale geliefert werden müssen.
Dieses System ist Teil der peripheren Toleranz, die den Körper vor Autoaggression schützen soll. Ein weiterer elementarer Teil der Toleranzinduktion ist neben den Treg die zentrale Toleranz, die im Thymus durch positive und negative Selektion induziert wird. Bei der positiven Selektion überleben nur die T-Zellen, die ausreichend stark an MHC-Moleküle der Klasse 1 bzw. 2 binden. Hier entscheidet sich auch, ob die T-Zelle zu einer Th oder einer CTL reift (MHC1 zu CTL; MHC2 zu Th). Bei der negativen Selektion werden endogen exprimierte oder durch Zirkulation im Thymus vorhandene Eigen-AG aus der Peripherie präsentiert und T-Zellen, die diese binden, eliminiert. Auf diese Weise wird sichergestellt, dass eine Erkennung der gewünschten Zielzellen im Rahmen einer Abwehrreaktion überhaupt in ausreichend spezifischem Maße möglich ist. [Mauricio et. al., 1998; Wucherpfennig et al., 2001]
Wie kann es also passieren, dass diese hoch differenzierten Mechanismen bei T1D scheinbar umgangen werden?
Hierzu gibt es unterschiedliche Theorien:
Eine davon hängt mit sogenanntem „ tissue remodelling “ zusammen. Sie setzt bei der Frage an, woher die AG kommen, die für die T-Zell-Aktivierung von den APC mit Costimulus präsentiert werden müssen. Über die normalen turn-over-Prozesse hinaus erfolgt „tissue remodelling“ in bestimmten Geweben zu unterschiedlichen Zeiten in Form von Apoptose und Nekrose, meist im Rahmen neonataler Umstrukturierungsprozesse [Meier et al., 2000]. Dies geschieht bei den untersuchten Säugern auch mit den ß-Zellen des Pankreas [Trudeau et al., 2000; Finegood et al., 1995].
Dadurch wird eine Welle von ß-Zell-AG freigesetzt - hierunter möglicherweise auch noch unfertige, teilweise glykosylierte Formen von ß-Zell-Komponenten, mit denen das Immunsystem in dieser Form noch nicht konfrontiert wurde und die so auch nicht als körpereigen erkannt werden. Bestimmte PAMPs (pathogen-associacted molecular patterns) wie beispielsweise Lipopolysaccharide können dann von entsprechenden PRRs (pattern recognition receptors) erkannt werden, die der APC mehrere Reize setzen. Neben der Präsentation der Pathogenbestandteile auf der Zelloberfläche mit dem MHC, wird die Expression von Costimuli hochreguliert. [Gelman et al., 2004]
Zu den costimulativen Signalen gehören grob unterteilt drei Gruppen:
1) die B7-Familie, die sowohl aktivierende als auch inhibierende Signale produzieren kann,
2) die TNF-Familie, die v.a. für eine Verstärkung der T-Zell-Aktivierung nötig ist, und
3) die Cytokine, die darüber entscheiden, in welche Richtung die T-Zellstimulation geht: Th1 oder Th2. [Pardoll, 2002]
So wandern die APC in die PLN (Pankreatischen Lymphknoten) und treffen an diesem Sammelort auf die T-Zellen. Dieser Ablauf scheint wichtig zu sein, da eine PLN-Ektomie bei NOD-Mäusen eine Insulitis verhindern konnte [Pirot et al., 2008].
In den PLN spaltet sich der Vorgang nun in mehrere Wege bzw. Hypothesen auf:
1. Th: Th werden durch ihr vom MHC2 präsentiertes AG in Kombination mit costimulatorischen Signalen aktiviert. Naive Th (Th0) können grundsätzlich zwei Hauptwege einschlagen. Welcher genommen wird, hängt vor allem von den präsenten Cytokinen ab.
Entweder differenzieren Th mit Hilfe von IL-12 bzw. IFNg zu Th1, die für zellulär-inflammatorische Reaktionen konzipiert sind. Die von ihnen produzierten Cytokine wie IL-2 und IFNg aktivieren Makrophagen und CTL-Zellen und wirken im weitesten Sinne entzündungsfördernd und gewebsdestruktiv (s.u.). [Kukreja et al., 1999] (S. Abb. 3a))
Oder Th werden mit IL-4 zu Th2, die insbesondere die humorale Abwehr stimulieren. Dies erfolgt durch Interaktion mit B-Zellen und deren resultierende Umwandlung in AK-produzierende Plasmazellen. (S. Abb. 3b))
Th1- und Th2-Weg können nicht gleichzeitig beschritten werden, da die T-zellspezifischen Mediatoren, jeweils die andere Th-Ausprägung hemmen - es kommt also immer zu einer eindeutigen Orientierung. [Kukreja et al., 1999]
Da es sich bei T1D um ein inflammatorisches Geschehen handelt, trotzdem aber vor der beobachtbaren ß-Zelldestruktion AK nachweisbar sind, geht man davon aus, dass es in der Krankheitsentwicklung irgendwann durch einen unbekannten Triggerfaktor zu einem „switch“ von Th2- zu Th1-dominierter Abwehrreaktion kommt. [Klinische Pathophysiologie, 2006]
Dazu passt die Beobachtung einer „malignen“ und einer „benignen“ Insulitis als Manifestation eines Th1- bzw. Th2-Übergewichts. In beiden Fällen ist die ß-Zellumgebung von Leukozyten invadiert und auch AK sind nachweisbar. Aber bei der malignen Form werden im Übermaß proinflammatorische Cytokine (IL-1, TNFa, IFNa) zusammen mit Th1-Cytokinen (IFNg, TNFß, IL-2, IL-12) nachgewiesen, während es bei der benignen Th2-spezifische Cytokine sind (IL-4, IL-10) [Kurkreja et al., 1999]. So kommt es nur bei der malignen Insulitis tatsächlich zu einer Destruktion, während die benigne ohne beobachtbare Schäden über Jahre bestehen kann [Klinische Pathophysiologie, 2006].
Diese Wege sind jedoch nie isoliert zu betrachten, da neben Th1 noch viele andere Faktoren im Immungeschehen involviert sind. So können Th1 beispielsweise mit ihren Cytokinen CTL stimulieren, während NKZ mit IL-4 Th2 oder IFNg Th1 aktivieren können. Auf solche Mechanismen wird in späteren Kapiteln im Rahmen ihrer Modulation mit MSC noch detaillierter eingegangen.
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Abb. 3: Autoimmungeschehen bei T1D, eigene Darstellung
APC präsentieren mit Hilfe von MHC-Molekülen (z.B. bestimmt durch DR3, DR4, DQ-Allele) AG, wie z.B. Peptidbruchstücke des Insulinmoleküls.
a) Naive Th0 differenzieren, durch IL-12 stimuliert, zu aktivierten Th1 Zellen, die inflammatorische Cytokine wie IFNg produzieren, welche wiederum APC aktivieren. Diese greifen einerseits mit radikalischen Mechanismen die ß-Zellen an, gleichzeitig tragen sie aber auch zur Produktion inflammatorischer Cytokine bei.
b) durch IL-4 stimuliert differenzieren die Th0 zu Th2 aus, die die B-Zelldifferenzierung und damit letztendlich die AK-Produktion fördern. Inwieweit AK zu der ß-Zelldestruktion beitragen ist noch unbekannt.
c) wird das AG mit MHC1 und nicht mit MHC2 präsentiert können CTL aktiviert werden, die u.a. über den Fas-Weg die Apoptose der ß-Zellen induzieren können.
APC = Antigen-präsentierende Zelle, CTL = cytotoxische T-Zelle, Th = T-Helferzelle, DC = dendritische Zelle, IFN = Interferon, IL = Interleukin, TNF = Tumor Nekrose Faktor, LT = Leukotriene, NO = Nitritoxid, PGE = Prostaglandin, TCR = T-Zell-Rezeptor
2. CTL: CTL werden durch ihr vom MHC1 präsentiertes AG in Kombination mit costimulatorischen Signalen aktiviert, was zu einer erhöhten Expression von Fas-Liganden auf ihrer Zelloberfläche führt [Andersen et al., 2006]. Diese können an Fas-Rezeptoren auf der Oberfläche der ß-Zellen binden und über Bildung des DISC und die Caspasen-Kaskaden den Zelltod auslösen. Dieser ist auch das Ziel des Perforin-Weges. Perforin wird bei der Degranulation der CTL ausgeschüttet und „perforiert“ die Membran der anzugreifenden Zelle, so dass ebenfalls abgegebenes Granzym in die Zelle eindringen kann. Diese Serin-Esterase aktiviert durch Schneiden ebenfalls Caspasen und induziert so die Apoptose [Bots et al., 2006]. Wenn die CTL ihre AG auf der ß-Zelle erkennt, kann selbige auf diese Weise zerstört werden. Diesen Weg bezeichnen Mathis et al., 2001 als „recognition-linked mechanism“ (S. Abb. 4a)), da es um eine Erkennung der AG auf der ß-Zelle selbst geht. Dieser Mechanismus basiert hauptsächlich auf den Aktionen von CTL (S. Abb. 3c))
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Abb. 4: Zelluläre Mechanismen des ß-Zelltodes [Mathis et al., 2001]
a) nach „recognition linked mechanism“: die CTL wird durch die direkte Erkennung der ß-Zell-AG (rote Punkte) aktiviert, welche von MHC auf der Oberfläche der ß-Zelle präsentiert werden. Die Aktivierung provoziert den Tod der ß-Zelle durch Zellkontakt z.B. über den Fas- oder Perforin-Weg.
b) nach „activation-linked mechanism“: die T-Zelle (CTL oder Th) erkennt das ß-Zell-AG das ihr indirekt durch benachbarte APC präsentiert wird. Die resultierende Aktivierung löst den ß-Zelltod aus durch die Mechanismen i – iii (s. Text)
Die andere Theorie von Mathis et al. beschreibt der „activation-linked mechanism“ (S. Abb. 4b)), da CTL wie Th über die AG-Erkennung auf APC indirekt aktiviert und so verschiedene ß-Zell-destruktive Prozesse ausgelöst werden (S. Abb. 4):
i. ß-Zelltod durch Oberflächenrezeptoren wie Fas und TNF-R [Kägi et al., 1999]
ii. Produktion von Cytokinen und anderen zellschädigenden Mediatoren aus T-Zellen
iii. Aktivierung von APC / Makrophagen und ihrer cytotoxischen Aktivitäten wie Radikalgeneration (NO, ROS) durch Th1 (CD40, IFNg, IL-2, TNF etc.)
iv. Anregung der ß-Zellen selbst zusammen mit T-Zellen, die für sie schädigenden oder chemotaktischen Mediatoren wie IFNg, IL-1, IL-6, TNFa, NO etc. zu produzieren [Cnop et al., 2005]
Diese Theorie hat den Vorteil, dass sie einige Widersprüche auflöst. So z.B. dass Th in der NOD-Maus ohne CTL-Beteiligung Diabetes auslösen können, auf murinen ß-Zellen aber gar keine MHC2-Moleküle nachweisbar sind. D.h. die Erkennung des AG kann nicht nur, wie es für CTL ausreichend wäre, direkt auf der Oberfläche der ß-Zelle stattfinden, sondern muss über APC gehen. So wird auch bei der Inaktivierung von Makrophagen die T1D-Entstehung fast komplett unterbunden [Yoon et al., 1998]
Neben den postulierten Mechanismen scheint die Generierung von Radikalen wie NO, ROS nach der Okamoto-Hypothese ebenfalls eine tragende Rolle zu spielen. Diese entwickelte sich aus der Erforschung der Wirkmechanismen der ß-Zell-Toxika Alloxan und STZ (s. Kap. 2.2.1). Die Suche führte auf die Ebene der DNA. Die Akkumulation freier Radikale kann zu DNA-Strangbrüchen führen. Diese werden von der PARP (Poly-ADP-Ribose-Polymerase) repariert, wobei NAD verbraucht wird. Der NAD-Abfall beeinträchtigt zunächst die zellulären Funktionen wie u.a. auch die Insulinsekretion und führt letztendlich zur Nekrose der ß-Zelle. Dies führt wiederum zu einem Mehr an Zelltrümmern, die von APC aufgenommen werden können und die Immunreaktion in Gang halten bzw. auch weitere Nekrosen und Apoptosen begünstigen. [Okamoto et al., 2002]
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