Identifizierung von mit HMGA2 interagierenden Proteinen

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung

2 Materialien

2.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien

2.2 Chemikalien

2.3 Lösungen und Puffer

2.4 Medien

2.5 Hefestämme

2.6 Bakterienstämme

2.7 DNA-Molekulargewichtsmarker

2.8 Primer

2.9 Vektoren

2.10 Kits

2.11 Enzyme

2.12 Software

3 Methoden

3.1 Kultivierung von Prokaryoten

3.1.1 Kultivierung von Prokaryoten auf Agarplatten

3.1.2 Flüssigkulturen von Prokaryoten

3.1.3 Anlegen von Glycerolstocks

3.2 Kultivierung von Eukaryoten

3.2.1 Kultivierung von Eukaryoten auf Agarplatten

3.2.2 Flüssigkulturen von Eukaryoten

3.3 Isolierung von Plasmid DNA aus Prokaryoten

3.3.1 Plasmid Midiprep mittels QIAGEN® Plasmid Midi Kit

3.3.2 Plasmid Maxiprep mittels QIAGEN® Plasmid Maxi Kit

3.3.3 Schnelle DNA-Isolierung

3.4 Isolierung von Plasmid DNA aus Eukaryoten

3.4.1 DNA-Isolierung aus S. cerevisiae mittels QIAprep® Spin Miniprep Kit

3.4.2 DNA-Isolierung aus S. cerevisiae mittels QIAGEN® Plasmid Mini Kit und Lyticase

3.5 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung

3.5.1 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung mittels Photometrie

3.5.2 Konzentrationsbestimmung mittels Agarose-Gelelektrophorese

3.6 Restriktionsverdau

3.6.1 Restriktionsverdau zum Qualitätstest von Plasmiden

3.6.2 Restriktionsverdau zur Klonierung von DNA-Fragmenten

3.7 Dephosphorylierung

3.8 Ligation

3.9 Agarose-Gelelektrophorese

3.10 Aufreinigung von DNA aus einem Agarosegel

3.10.1 Aufreinigung von DNA mittels QIAquick™ Gel Extraction Kit

3.10.2 Aufreinigung von DNA mittels QIAEX® II Gel Extraction Kit

3.11 PCR-Purification mittels QIAquick™ PCR Purification Kit

3.12 Transformation in Prokaryoten

3.12.1 Herstellung thermokompetenter Bakterien E. coli DH5α

3.12.2 Thermotransformation in Prokaryoten

3.12.3 Ermittlung der Transformationseffizienz

3.13 Transformation in Eukaryoten

3.13.1 Herstellung kompetenter Hefezellen S. cerevisiae AH109

3.13.2 PEG/LiAc-Transformation in Eukaryoten (Gietz et al., 1992)

3.13.3 Ermittlung der Transformationseffizienz

3.14 Polymerase Kettenreaktion

3.14.1 Ermittlung der optimalen Annealing-Temperatur mittels Gradienten-PCR

3.14.2 PCR zur Überprüfung der PEG/LiAc-Transformation in Eukaryoten

3.15 Sequenzierung

4 Ergebnisse

4.1 Isolierung von Plasmid DNA und Überprüfung der Vektoren

4.1.1 Photometrische Konzentrationsbestimmung isolierter Plasmid DNA

4.1.2 Restriktionsverdau zur Überprüfung der Vektoren pGBKT7 und pET-3a-HMGA2

4.2 Klonierung von HMGA2 in pGBKT7

4.2.1 Restriktionsverdau der Vektoren pET-3a-HMGA2 und pGBKT7

4.2.2 Ligation des Vektors pGBKT7 mit dem HMGA2-Insert

4.3 Transformation des Vektors pGBKT7-HMGA2 in E. coli

4.3.1 Zählung der gewachsenen Klone und Ermittlung der Transformationseffizienz

4.3.2 Restriktionsanalysen des Vektors pGBKT7-HMGA2 nach Schnellprep

4.3.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung nach Midiprep

4.3.4 Restriktionsverdau nach Midiprep

4.4 Sequenzierung

4.5 Transformation des Vektors pGBKT7-HMGA2 in S. cerevisiae

4.5.1 Ermittlung der Transformationseffizienz

4.6 PCR-Analysen

4.6.1 Gradienten-PCR zur Ermittlung der optimalen Annealing-Temperatur verschiedener Primer

4.6.2 PCR zur Überprüfung der Transformation von pGBKT7-HMGA2 in S. cerevisiae

5 Diskussion

6 Zusammenfassung

Zielsetzung & Themen

Das primäre Ziel dieser Diplomarbeit war die Identifizierung von HMGA2-interagierenden Proteinen mittels Yeast-2-Hybrid-Systemen. Hierbei sollte ein Bait-Vektor (pGBKT7-HMGA2) konstruiert und in Saccharomyces cerevisiae transformiert werden, um Interaktionen innerhalb einer cDNA-Library zu untersuchen.

• Methoden der Proteinteraktion und Proteomik
• Klonierungsstrategien von HMGA2 in den Bait-Vektor pGBKT7
• Transformation von Prokaryoten und Eukaryoten
• Analyse von DNA-Konzentrationen und Reinheit
• Validierung durch PCR und Restriktionsanalyse

Auszug aus dem Buch

Zusammenfassung der Kapitel

1 Einleitung: Theoretische Einführung in die Familie der HMG-Proteine, deren Funktion sowie die methodischen Grundlagen des Yeast-2-Hybrid-Systems.

2 Materialien: Auflistung der verwendeten Geräte, Chemikalien, Medien, Hefestämme, Bakterienstämme, Primer und Vektoren.

3 Methoden: Detaillierte Beschreibung der experimentellen Protokolle zur Kultivierung, DNA-Isolierung, Klonierung, Transformation und PCR-Analytik.

4 Ergebnisse: Darstellung der Klonierungsergebnisse, Konzentrationsmessungen und Analysen mittels Agarose-Gelelektrophorese.

5 Diskussion: Interpretation der erzielten Ergebnisse, Reflexion über aufgetretene Klonierungsprobleme und Ausblick auf zukünftige Forschungsansätze.

6 Zusammenfassung: Kompakte Übersicht über die wissenschaftliche Arbeit und deren zentrale Erkenntnisse bezüglich des Bait-Vektors pGBKT7-HMGA2.

Schlüsselwörter

HMGA2, HMG-Proteine, Yeast-2-Hybrid, Proteinteraktion, Bait-Vektor, Plasmid DNA, S. cerevisiae, Klonierung, PCR, Restriktionsverdau, Transformation, cDNA-Library, Proteinanalyse, Genexpression, Proteomik.

Häufig gestellte Fragen

Worum geht es in der Arbeit grundlegend?

Die Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen des HMGA2-Proteins mithilfe des Yeast-2-Hybrid-Verfahrens.

Was sind die zentralen Themenfelder?

Zentrale Themen sind die Molekularbiologie der HMG-Proteine, Klonierungstechniken sowie die funktionelle Analyse von Proteinkomplexen in vivo.

Was ist das primäre Ziel oder die Forschungsfrage?

Ziel ist es, bisher unbekannte Interaktionspartner für HMGA2 zu finden, um neue Erkenntnisse über dessen Rolle bei zellulären Prozessen zu gewinnen.

Welche wissenschaftliche Methode wird verwendet?

Die Arbeit nutzt hauptsächlich das Yeast-2-Hybrid-Screening-Verfahren, ergänzt durch klassische molekularbiologische Methoden wie PCR, Restriktionsverdau und Gelelektrophorese.

Was wird im Hauptteil behandelt?

Der Hauptteil befasst sich mit der detaillierten Konstruktion des Bait-Vektors pGBKT7-HMGA2, der anschließenden Transformation in E. coli und Hefezellen sowie der analytischen Überprüfung der Klonierungserfolge.

Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?

Wichtige Begriffe sind HMGA2, Yeast-2-Hybrid, Bait-Vektor, Proteinteraktion, Transformation und cDNA-Library.

Warum traten bei der Transformation in E. coli Schwierigkeiten auf?

Es wird vermutet, dass das HMGA2-Protein eine toxische Wirkung auf die verwendeten Bakterienzellen ausübte, was zu einem Selektionsvorteil für Klone ohne Insert führte.

Welche Schlussfolgerungen werden aus den Sequenzanalysen gezogen?

Die Sequenzierungen zeigten, dass das gewünschte HMGA2-Insert in den untersuchten Klonen nicht korrekt enthalten war, was weitere methodische Anpassungen für die Klonierungsstrategie erforderlich macht.