Klonierung des Phosphatidylinositol binding clathrin assembly proteins (PICALM) und Untersuchung der Interaktion mit dem Protein APP in Verbindung mit der Alzheimer Krankheit

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung

1.1 Alzheimer Erkrankung

1.1.1 Epidemiologie und Pathologie

1.1.2 Genetische Risikofaktoren

1.1.3 Histopathologie und Amyloid-Hypothese

1.2 Amyloid Precursor Protein

1.2.1 Prozessierung und intrazellulärer Transport von APP

1.3 PICALM

1.3.1 Expressionsmuster und zelluläre Lokalisation von PICALM

1.3.2 Assoziation von PICALM mit AD

1.4 Zielsetzung

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Zelllinien

2.1.2 Bakterienstämme

2.1.3 Kulturmedien

2.1.4 Antibiotika

2.1.5 DNA-Vektoren

2.1.6 Oligonukleotide

2.1.7 Labormaterialien und –chemikalien

2.1.8 Puffer

2.1.9 Kits

2.1.10 Antikörper

2.1.11 DNA- und Proteinstandards

2.1.12 Enzyme

2.1.13 Geräte

2.1.14 Software

2.2 Methoden

2.2.1 Zellkulturmethoden

2.2.2 Proteinmethoden

2.2.3 DNA-Methoden und Klonierung

3 Ergebnisse

3.1 Klonierung und Überexpression von PICALM

3.1.1 Expressionstest C-terminal getagter PICALM-Konstrukte

3.1.2 Klonierung von PICALM

3.1.3 Toxizitätsvergleich N- und C-terminal getagter Konstrukte

3.2 Interaktionstudien von PICALM mit APP

3.2.1 Einfluss der PICALM Überexpression auf endogene APP-Level

3.2.2 Einfluss der APP Überexpression auf endogene PICALM-Level

3.3 Fluoreszenzmikroskopie

3.3.1 Zelluläre Lokalisation von PICALM

3.3.2 Untersuchung möglicher Kolokalisation von PICALM und APP

4 Diskussion

4.1 Verwendete Zelllinien

4.2 Klonierung und Überexpression von PICALM

4.3 Interaktionstudien von PICALM mit APP

4.4 Fluoreszenzmikroskopie

4.4.1 Zelluläre Lokalisation von PICALM

4.4.2 Kolokalisationsstudien von PICALM und APP

5 Zusammenfassung

Zielsetzung & Themen

Das primäre Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der molekularen Interaktion zwischen PICALM und dem Amyloid Precursor Protein (APP) im Kontext der Alzheimer-Krankheit. Die Forschungsarbeit geht dabei der Hypothese nach, ob die bei der Alzheimer-Erkrankung als genetischer Risikofaktor identifizierten PICALM-Varianten die APP-Prozessierung oder deren zellulären Transport beeinflussen.

• Klonierung und stabile Überexpression von PICALM in murinen und humanen Zelllinien
• Analyse des Einflusses von PICALM-Überexpression auf endogene APP-Level
• Untersuchung der zellulären Lokalisation von PICALM mittels Fluoreszenzmikroskopie
• Prüfung einer möglichen Kolokalisation von PICALM und APP in der Zelle
• Evaluierung der Zytotoxizität verschiedener PICALM-Konstrukte

Auszug aus dem Buch

Zusammenfassung der Kapitel

1 Einleitung: Dieses Kapitel gibt einen Überblick über die Epidemiologie und Pathologie der Alzheimer-Krankheit, beschreibt die Amyloid-Hypothese, die Funktionen des Amyloid Precursor Proteins (APP) sowie die Rolle von PICALM als Clathrin-Adaptorprotein.

2 Material und Methoden: Hier werden die verwendeten Zelllinien (N2A, HEK), die molekularbiologischen Methoden zur Klonierung, Transfektion, Proteinanalytik (Western Blot, ICC) sowie die verwendeten Puffer, Antikörper und Geräte detailliert aufgelistet.

3 Ergebnisse: Die Ergebnisse präsentieren die erfolgreiche Klonierung von PICALM-Konstrukten, zeigen, dass eine Überexpression von PICALM zu einer Reduktion endogener APP-Level führt, und untersuchen die zelluläre Lokalisation mittels Fluoreszenzmikroskopie.

4 Diskussion: In diesem Teil werden die Resultate kritisch bewertet, wobei insbesondere der einseitige Effekt von PICALM auf APP und die möglichen Auswirkungen auf den endocytotischen Transport des Proteins im Kontext der Alzheimer-Pathogenese diskutiert werden.

5 Zusammenfassung: Das letzte Kapitel fasst die zentralen Befunde der Arbeit zusammen, wonach eine direkte funktionelle Verbindung zwischen PICALM und APP besteht, die wahrscheinlich über eine Beeinflussung der Clathrin-vermittelten Endocytose (CVE) vermittelt wird.

Schlüsselwörter

Alzheimer-Krankheit, PICALM, APP, Amyloid-beta, Clathrin-vermittelte Endocytose, Klonierung, Überexpression, Western Blot, Fluoreszenzmikroskopie, Zellkultur, HEK-293, N2A, Signaltransduktion, Neurodegeneration, Transportmechanismen.

Häufig gestellte Fragen

Worum geht es in dieser Bachelorarbeit grundsätzlich?

Die Arbeit untersucht die molekulare Verbindung zwischen dem Protein PICALM und dem Amyloid Precursor Protein (APP) im Zusammenhang mit der Alzheimer-Krankheit.

Welches sind die zentralen Themenfelder der Arbeit?

Die Arbeit fokussiert sich auf die Alzheimer-Pathologie, die Clathrin-vermittelte Endocytose (CVE), die molekularbiologische Klonierung von Proteinkonstrukten sowie die Analyse von Proteininteraktionen in Zellmodellen.

Was ist das primäre Ziel der Forschungsarbeit?

Das Hauptziel ist zu klären, ob PICALM die Menge oder den Transport von APP beeinflusst, da beide Proteine mit der Entstehung von Alzheimer-Plaques assoziiert sind.

Welche wissenschaftlichen Methoden wurden verwendet?

Es wurden molekularbiologische Standardtechniken wie PCR, Klonierung und bakterielle Transformation, sowie zellbiologische Methoden wie die Calcium-Phosphat-Transfektion, Western Blot Analyse, BCA-Proteinkonzentrationsbestimmung und Fluoreszenzmikroskopie (ICC) angewandt.

Welche Inhalte werden im Hauptteil behandelt?

Der Hauptteil gliedert sich in die Klonierung der PICALM-cDNA, die anschließende Überexpression in N2A- und HEK-Zellen, sowie die Durchführung von Interaktionsstudien und mikroskopische Analysen zur Lokalisation der Proteine.

Welche Begriffe charakterisieren die Arbeit am besten?

Wichtige Begriffe sind PICALM, APP, Alzheimer-Krankheit, Clathrin-vermittelte Endocytose, Proteininteraktion und Überexpression.

Welche Auswirkung hat die Überexpression von PICALM auf die APP-Level?

Die Arbeit zeigt, dass eine Erhöhung der PICALM-Konzentration in den Zellen zu einer stetigen Abnahme der endogenen APP-Proteinlevel führt.

Ist der Effekt der PICALM-APP-Interaktion wechselseitig?

Nein, die Ergebnisse zeigen, dass steigende Mengen von APP keinen signifikanten Einfluss auf die endogenen PICALM-Level haben, der Effekt ist also einseitig.

Sind PICALM und APP direkt miteinander interagierende Partner?

Die Kolokalisationsstudien deuten darauf hin, dass die Proteine zwar teilweise in ähnlichen Zellbereichen vorliegen, eine direkte, starke Bindung jedoch eher unwahrscheinlich ist; der Effekt wird vermutlich über andere Adaptorproteine vermittelt.