Untersuchung der DNA-Methylierung zellzyklus- und differenzierungsrelevanter Gene als mögliche Prognosefaktoren der akuten lymphatischen Leukämie mittels Pyrosequenzierung

Inhaltsverzeichnis

1. EINLEITUNG

1.1 Einführung

1.2 Die akuten lymphatischen Leukämien (ALL)

1.3 Prognosefaktoren und bedeutsame Untergruppen der ALL

1.4 Molekulare Prognosefaktoren der ALL

2. EPIGENETISCHE DNA-VERÄNDERUNGEN

2.1 DNA-Methylierung

2.2 Regulation der DNA-Methylierung

2.3 DNA-Metyhlierung und Tumorerkrankung

2.4 DNA-Methylierung bei der ALL

2.5 DNA-Methylierung als therapeutischer Ansatz

2.6 Methoden der Methylierungsanalyse

2.6.1 Methylierungsspezifische PCR (MSP)

2.6.2 Restriktionsenzyme

2.6.3 Immunpräzipitation durch spezifische Antikörper

2.6.4 Quantitative DNA-Methylierungsanalyse mittels Pyrosequenzierung

2.7 Primerdesign

2.8 Limitationen der Pyrosequenziertechnik

2.9 Auswahl der untersuchten Gene

3. FRAGESTELLUNGEN UND ZIEL DER ARBEIT

4. MATERIAL UND METHODEN

4.1 Probenmaterial

4.2 Material

4.2.1 Chemikalien/Reagenzien

4.2.2 Primer

4.2.3 Spezielle Verbrauchsmaterialien

4.2.4 Technische Geräte

4.3 Methoden

4.3.1. Zell-Isolierung

4.3.2 DNA-Extraktion

4.3.3 Bestimmung des DNA Gehaltes

4.3.4 Bisulfitkonvertierung

4.3.5 Erneute Bestimmung der DNA-Konzentration nach Bisulfidkonversion

4.3.6 Polymerase-Kettenreaktion

4.3.7 PCR-Produkt-Kontrolle mittels Gelagar-Elektrophorese

4.3.8 Template Präparation

4.3.9 Pyrosequenzierung

4.3.10 Oligonukleotid Micro-Array Analyse

4.3.11 Oligonukleotid Micro Array Daten-Analyse mittels Genespring

4.4. Statistische Tests

4.4.1 Korrelationskoeffizient

4.4.2 t-Test

4.4.3 Kruskal-Wallis Test und chi-Quadrat-Test

4.4.4 Kaplan-Meier Überlebenskurve

5. ERGEBNISSE

5.1. 14-3-3sigma (Stratifin)

5.1.1 Determinierung der CpG Region von 14-3-3sigma

5.1.2 Methlyierung von 14-3-3sigma

5.1.3 Expression von 14-3-3sigma

5.1.4 Korrelation der Genexpression und Methylierung von 14-3-3sigma mit klinischen Parametern

5.2 Heat shock protein 90 (Hsp90)

5.2.1 Determinierung der CpG Regionen von Hsp90

5.2.2 Methylierung von Hsp90

5.2.3 Expression von Hsp90

5.2.4 Korrelation der Genexpression und Methylierung von Hsp90 mit klinischen Parametern

5.3 METAP2

5.3.1 Determinierung der CpG Regionen von METAP2

5.3.2 Methylierung von METAP2

5.3.3 Expression von METAP2

5.3.4 Korrelation der Genexpression und Methylierung von METAP2 mit klinischen Parametern

5.4 Pax5

5.4.1 Determinierung der CpG Regionen von Pax5

5.4.2 Methylierung von Pax5

5.4.3 Expression von Pax5

5.4.4 Korrelation der Genexpression und Methylierung von Pax5 mit klinischen Parametern

5.5 Thioredoxin binding protein 2

5.5.1 Determinierung der CpG Region von Thioredoxin binding protein 2

5.5.2 Methylierung von Thioredoxin binding protein 2

5.5.3 Expression von Thioredoxin binding protein 2

5.6 Rho A

5.6.1 Determinierung der CpG Region von Rho A

5.6.2 Methylierung und Expression von Rho A

6. DISKUSSION

6.1 14-3-3sigma

6.1.1 Die Gruppe der 14-3-3-Proteine

6.1.2 Funktion der 14-3-3-Proteine

6.1.3 Einfluß der 14-3-3-Proteine auf den Zellzyklus

6.1.4 Chemoresistenz durch DNA-Reparatur und Zellzyklusarrest

6.1.5 Einfluß von 14-3-3-Proteinen auf die Apoptose mittels BAD

6.1.6 Einfluß der 14-3-3-Proteine auf die Apoptose

6.1.7 Genmetyhlierung von 14-3-3sigma

6.1.8 Ausblick: Inhibierung der 14-3-3-Proteine

6.2 Hsp90

6.2.1 Funktion von Hsp90

6.2.2 Hsp90 und KIT

6.2.3 Methylierung des Hsp90-Gens

6.3 METAP2

6.3.1 Funktion von METAP2

6.3.2 Die Rolle von METAP2 bei der ALL

6.3.3 Metyhlierung von METAP2

6.4 Pax5

6.4.1 Die Funktion von Pax5

6.4.2 Regulation und Dysregulation von Pax5

6.4.3 Rolle von Pax5 bei der ALL

6.4.4 Metyhlierung von Pax5

6.5 Thioredoxon binding protein 2

6.5.1 Zur Funktion von Thioredoxin und Thioredoxin binding protein 2

6.5.2 Überexpression von Thioredoxin

6.5.3 Methylierung von Thioredoxin binding protein 2

6.6 Rho A

6.6.1 Funktion von Rho A

6.6.2 Funktionelle Aspekte der GDI

6.6.3 Funktionelle Bedeutung der GDI-vermittelten Inhibierung des MAP-Signalwegs

6.6.4 Methylierung und Rho A

7. ZUSAMMENFASSUNG UND SCHLUSSFOLGERUNG

8. LITERATURVERZEICHNIS

Zielsetzung & Themen

Die Habilitationsschrift untersucht die DNA-Methylierung von zellzyklus- und differenzierungsrelevanten Genen bei lymphatischen Leukämien, insbesondere der T-Zell-Reihe (T-ALL), um deren Eignung als prognostische Marker zu evaluieren und die therapeutische Relevanz epigenetischer Modifikationen zu erforschen.

• Analyse der DNA-Methylierung mittels quantitativer Pyrosequenzierung.
• Untersuchung von sechs spezifischen Genen (14-3-3sigma, Rho A, Thioredoxin binding protein 2, Hsp90, Pax5 und METAP2).
• Korrelation von Methylierungsmustern mit Genexpressionsdaten und klinischen Parametern.
• Risikostratifizierung und Identifikation potenzieller therapeutischer Zielstrukturen bei akuten lymphatischen Leukämien.

Auszug aus dem Buch

Zusammenfassung der Kapitel

1. EINLEITUNG: Einführung in die Bedeutung molekularer Marker und epigenetischer Veränderungen bei der T-ALL sowie Zielsetzung der Arbeit.

2. EPIGENETISCHE DNA-VERÄNDERUNGEN: Theoretische Grundlagen zu DNA-Methylierung, ihrer Regulation, den Methoden zur Analyse und der Auswahl der relevanten Zielgene.

3. FRAGESTELLUNGEN UND ZIEL DER ARBEIT: Definition der Forschungsfrage hinsichtlich der epigenetischen Charakterisierung von Prognosefaktoren bei T-ALL.

4. MATERIAL UND METHODEN: Detaillierte Beschreibung des verwendeten Patientenmaterials und der angewandten molekularbiologischen sowie statistischen Methoden.

5. ERGEBNISSE: Darstellung der Ergebnisse zur Methylierung und Expression der sechs untersuchten Gene 14-3-3sigma, Hsp90, METAP2, Pax5, Thioredoxin binding protein 2 und Rho A.

6. DISKUSSION: Interpretative Einordnung der Ergebnisse unter Berücksichtigung der Fachliteratur und biologischer Signalwege.

7. ZUSAMMENFASSUNG UND SCHLUSSFOLGERUNG: Zusammenfassende Bewertung der Ergebnisse und Ausblick auf die klinische Relevanz der untersuchten Marker.

Schlüsselwörter

T-ALL, B-ALL, DNA-Methylierung, Pyrosequenzierung, Epigenetik, 14-3-3sigma, Hsp90, METAP2, Pax5, Thioredoxin, Prognosefaktoren, Genexpression, Leukämie, Tumorsuppressorgene, Chemoresistenz

Häufig gestellte Fragen

Worum geht es in dieser wissenschaftlichen Arbeit grundlegend?

Die Arbeit untersucht den epigenetischen Methylierungsstatus spezifischer Gene bei der akuten lymphatischen Leukämie (ALL), insbesondere der T-Zell-Reihe (T-ALL), und deren mögliche Funktion als Prognosemarker.

Welches sind die zentralen Themenfelder der Untersuchung?

Die Schwerpunkte liegen auf der DNA-Methylierung, der Korrelation zwischen Methylierungsgrad und Genexpression sowie der Analyse des Einflusses dieser molekularen Veränderungen auf den klinischen Verlauf der Leukämieerkrankung.

Was ist das primäre Ziel der Habilitationsschrift?

Ziel ist es, einen Beitrag zur Identifikation neuer epigenetischer Prognosemarker zu leisten, die eine präzisere Risikostratifizierung bei T-ALL-Patienten ermöglichen könnten.

Welche wissenschaftliche Methode wird primär zur Analyse verwendet?

Die Arbeit nutzt die quantitative DNA-Methylierungsanalyse mittels Pyrosequenzierung sowie die Analyse der Genexpression mittels Oligonukleotid Micro-Arrays.

Was wird im Hauptteil der Arbeit detailliert behandelt?

Der Hauptteil befasst sich mit der detaillierten Untersuchung von sechs spezifischen Genen (14-3-3sigma, Rho A, Thioredoxin binding protein 2, Hsp90, Pax5 und METAP2) und deren regulatorischer Rolle bei verschiedenen Phasen der Zellzyklusregulation und Differenzierung.

Welche Schlüsselwörter charakterisieren die vorliegende Arbeit?

Die zentralen Schlagworte sind T-ALL, DNA-Methylierung, Pyrosequenzierung, Epigenetik, Prognosefaktoren und Genexpression.

Welche Rolle spielt die Pyrosequenzierung bei der Analyse der T-ALL Proben?

Die Pyrosequenzierung ermöglicht die quantitative Bestimmung des Methylierungsgrades, was im Vergleich zu älteren, semiquantitativen Methoden eine präzisere Auswertung und Identifikation von Methylierungsmustern in den Patientenproben zulässt.

Welche Erkenntnisse wurden zur Korrelation von Genmethylierung und klinischem Ansprechen gewonnen?

Die Ergebnisse zeigen, dass bei einigen Genen wie METAP2 und Pax5 eine Korrelation besteht, wobei ab einem kritischen Methylierungsgrad keine Steigerung der Genexpression mehr möglich ist, was Auswirkungen auf den klinischen Krankheitsverlauf hat.

Können die untersuchten Gene als unabhängige Prognosefaktoren für die T-ALL angesehen werden?

Die Ergebnisse deuten bei einigen Markern auf eine Relevanz für das klinische Outcome hin, jedoch betont der Autor, dass aufgrund der teilweise geringen Fallzahlen weiterführende Studien notwendig sind, um sie als robuste klinische Prognosefaktoren zu etablieren.