Chemische und enzymatische Synthese modifizierter Nukleinsäuren für die Analytik mit Hilfe der MALDI-TOF Massenspektrometrie

Inhaltsverzeichnis

I Einleitung

1 Wachsende Bedeutung der DNA-Analytik

2 Nachteile klassischer Methoden der DNA-Analytik

3 MALDI-TOF Massenspektrometrie zur Analyse von Biomolekülen

4 Massenspektrometrie von Nukleinsäuren

II Problemstellung

III Ergebnisse und Diskussion

1 Einführung

2 Das Pyrrolo[2,3-d]pyrimidinsystem

2.1 Biologische Bedeutung

2.2 Nomenklatur

3 Synthese von 7-Deaza-2-desoxyguanosin und 7-Deaza-2-desoxyadenosin

3.1 Darstellung der Aglykone

3.2 Synthese geeigneter Akzeptoren für Glykosidierungsreaktionen

3.3 Synthese von Glykosyldonoren

3.4 Glykosidierungsreaktionen

3.5 Abspaltung der Schutzgruppen aus den Glykosidierungsprodukten

4 Chemische Festphasensynthese von Oligodesoxynukleotiden

4.1 Die Phosphoamiditmethode

4.2 Darstellung von Monomeren für die DNA-Synthese

4.3 Benzoyl- und Isobutyryl-Gruppe als exozyklische Aminoschutzgruppen

4.4 4-tert-Butylphenoxyessigsäure als Schutzgruppe für exozyklische Aminogruppen

4.5 Phosphoamiditsynthese

4.6 Festphasengebundene Synthese modifizierter Nukleinsäuren

5 Enzymatische Darstellung modifizierter Nukleinsäuren

5.1 Die Polymerasekettenreaktion

5.2 Wahl von Primer-Template-Systemen für die PCR

5.3 Wahl einer geeigneten DNA-Polymerase für die PCR

5.4 Erfolgreicher Einbau der modifizierten Triphosphate

5.5 Effektivität des Einbaus von 7-Deazanukleosidtriphosphaten

6 Analytik doppelsträngiger DNA mit Hilfe der MALDI-TOF Massenspektrometrie

6.1 Analyse der 103-mer PCR-Produkte aus M13mp18

6.2 Analyse der 99-mer PCR-Produkte aus pHis6Bap

6.3 Restriktionsverdau der 99-mer PCR-Produkte

6.4 Ribomodifizierte Primer zur Darstellung 7-deaza-modifizierter Nukleinsäuren

7 Massenspektrometrie einzelsträngiger DNA

7.1 Analytik synthetischer Homopolymere von 7-Deaza-2-desoxyadenosin

7.2 Das Streptavidin-Biotin-System

7.3 Asymmetrische PCR mit biotinmodifizierten Primern

7.4 Darstellung und Massenspektrometrie komplett c7-modifizierter Nukleinsäuren

8 DNA-Sequenzanalyse

8.1 Vermessung einer modifizierten synthetischen DNA-Leiter

8.2 DNA-Sequenzierung mit Hilfe einer Endonuklease

9 Modifikation des Zuckers zur Stabilisierung der DNA

9.1 Enzymatische Reaktionen mit 2-Fluoro-2-desoxynukleosidtriphosphaten

9.2 2-Fluorocytidin in einem synthetischen Oligonukleotid

9.3 Kombination von Basen- und Zuckermodifikation

10 Konzept eines massenspektrometrischen Polymerase-Inkorporations-Assays

IV Zusammenfassung

V Summary

VI Diskussion und Ausblick

VII Experimenteller Teil

VIII Literaturverzeichnis

Zielsetzung & Themen

Die vorliegende Arbeit untersucht Möglichkeiten zur Stabilisierung von Nukleinsäuren gegenüber der säurekatalysierten Depurinierung unter den Bedingungen der MALDI-TOF Massenspektrometrie durch chemische Modifikation. Ziel ist es, durch den Einsatz von 7-Deazapurinen und 2-Fluorozuckermodifikationen die massenspektrometrische Analyse von DNA, insbesondere im Hinblick auf Sensitivität und Auflösung, maßgeblich zu verbessern sowie die Anwendung in enzymatischen Verfahren wie der PCR und der DNA-Sequenzierung zu evaluieren.

• Synthese modifizierter 7-Deazapurin-2-desoxynukleoside als Bausteine für die DNA-Synthese.
• Chemische Festphasensynthese von modifizierten Oligonukleotiden mittels Phosphoamiditchemie.
• Optimierung des enzymatischen Einbaus modifizierter Triphosphate in der PCR.
• Massenspektrometrische Analytik von modifizierter doppel- und einzelsträngiger DNA.
• Evaluation von Methoden zur Probenkonditionierung und Immobilisierung (Streptavidin-Biotin-System).

Auszug aus dem Buch

Zusammenfassung der Kapitel

I Einleitung: Beschreibt die Bedeutung der DNA-Analytik, die Limitationen klassischer Methoden und führt in die Grundlagen der MALDI-TOF Massenspektrometrie ein.

II Problemstellung: Erläutert die säurekatalysierte Depurinierung als Hauptursache für Signalverschlechterungen bei der MALDI-TOF MS von Nukleinsäuren und definiert die Synthese von 7-Deazapurinen als Lösungsansatz.

III Ergebnisse und Diskussion: Detaillierte Darstellung der Synthese modifizierter Basen, der Festphasensynthese modifizierter Oligonukleotide sowie deren Anwendung in enzymatischen Reaktionen und MALDI-TOF Analysen.

IV Zusammenfassung: Fasst die Ergebnisse der Arbeit zusammen, insbesondere die verbesserte Stabilität und Analytik durch die Kombination von Basen- und Zuckermodifikationen.

V Summary: Englische Zusammenfassung der wissenschaftlichen Erkenntnisse.

VI Diskussion und Ausblick: Kritische Würdigung der erreichten Ergebnisse und Diskussion zukünftiger Entwicklungen in der massenspektrometrischen DNA-Analytik.

VII Experimenteller Teil: Dokumentation der verwendeten Geräte, Chemikalien, Syntheseprotokolle und analytischen Daten.

VIII Literaturverzeichnis: Umfassende Auflistung der für die Arbeit relevanten wissenschaftlichen Quellen.

Schlüsselwörter

MALDI-TOF Massenspektrometrie, DNA-Analytik, 7-Deazapurine, 2-Fluoronukleotide, Oligonukleotidsynthese, Phosphoamiditmethode, PCR, Depurinierung, Nukleinsäuren, Massenauflösung, Biotin-Streptavidin-System, Sequenzanalyse, Zuckermodifikation, DNA-Stabilität, Probenkonditionierung

Häufig gestellte Fragen

Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?

Die Arbeit befasst sich mit der Verbesserung der massenspektrometrischen Analyse von DNA durch chemische Modifikationen, um die bei MALDI-TOF Messungen auftretende Depurinierung zu unterbinden.

Was sind die zentralen Themenfelder?

Die zentralen Felder umfassen die organische Synthese modifizierter Nukleoside, deren Inkorporation in Oligonukleotide via Festphasensynthese sowie deren Einsatz in enzymatischen Reaktionen wie der Polymerasekettenreaktion.

Was ist das primäre Ziel der Forschungsarbeit?

Das primäre Ziel ist die Steigerung der Stabilität, Nachweisempfindlichkeit und Massenauflösung bei der MALDI-TOF Analyse von Nukleinsäuren durch den Einbau von 7-Deazapurinen und modifizierten Zuckereinheiten.

Welche wissenschaftliche Methode wird primär verwendet?

Die primäre analytische Methode ist die MALDI-TOF Massenspektrometrie, ergänzt durch klassische organische Synthesemethoden und enzymatische Amplifikationstechniken wie die PCR.

Was wird im Hauptteil behandelt?

Der Hauptteil gliedert sich in die chemische Synthese der modifizierten Synthesebausteine, die Festphasensynthese der modifizierten Oligonukleotide und die Untersuchung ihres Verhaltens in biochemischen Prozessen und massenspektrometrischen Analysen.

Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?

Die Arbeit wird durch Begriffe wie MALDI-TOF MS, 7-Deazapurine, 2-Fluoronukleotide, Festphasensynthese und DNA-Stabilisierung charakterisiert.

Warum ist die Depurinierung ein Problem bei der MALDI-TOF MS von DNA?

Die Depurinierung führt während des MALDI-Prozesses zur Fragmentierung der DNA, was das Molekülionensignal durch Peaktailing verschlechtert und die massenspektrometrische Bestimmung der Molekülmasse erheblich erschwert.

Welchen Vorteil bietet die 7-Deazamodifikation?

Durch das Ersetzen des N7-Stickstoffatoms im Purinring durch eine Methingruppe wird die Stabilität gegenüber saurer Hydrolyse drastisch erhöht, was die Fragmentierung bei der Desorption und Ionisation im Massenspektrometer stark reduziert.