Entwicklung eines "plant-based" Impfstoffs gegen den Lungenwurm des Rindes

Inhaltsverzeichnis

Zusammenfassung

Abstract

Anhangsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

Tabellenverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

1. Einleitung
1.1 Impfstoffe
1.2 Gentechnik in Pharmazeutikaherstellung
1.3 Die Dictyokaulose des Rindes
1.3.1 Erreger
1.3.2 Lebenszyklus
1.3.3 Klinik und Krankheitsverlauf
1.3.4 Diagnose
1.3.5 Immunität und Vorbeugung
1.3.6 Entwicklung eines Impfstoffes gegen den Lungenwurm des Rindes
1.4 Phenylethanolamin-N-Methyltransferasen (PNMT)
1.5 Superoxid-Dismutase (SOD)
1.6 Phosphinothricin (BASTA®)
1.7 Expression systems
1.8 Konzeption der vorliegenden Arbeit

2. Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Geräte und Materialien
2.1.2 Chemikalien und Lösungen
2.1.3 Enzyme, Puffer und PCR-Bestandteile
2.1.4 Größenstandards
2.1.5 Primer
2.1.6 DetectX® Superoxide Dismutase
2.2 Methoden
2.2.1 Kultur transgener Tabak
2.2.2 Leaf Paint Assay
2.2.3 Nomenklatur
2.2.4 DNA-Isolation
2.2.4.1 Schnelle Methode
2.2.4.2 DNA-Isolation CTAB-Methode
2.2.5 Vergleich transgener und nicht-transgener Pflanzen
2.2.6 PCR
2.2.7 Agarosegelelektrophorese
2.2.8 RT-PCR
2.2.8.1 RNA-Isolation
2.2.8.2 cDNA-Synthese
2.2.9 Proteinisolation
2.2.9.1 Proteinisolation mit Extraktionpuffer
2.2.9.2 Proteinisolation mit PBS
2.2.10 Western-Blot und Protein Detektion auf SDS-PAGE
2.2.10.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
2.2.10.2 Western-Blot
2.2.11 Enzyme assay Superoxide Dismutase (SOD)
2.2.11.1 Assay-Prinzip
2.2.11.2 Standard- und Proben- Vorbereitung

3. Ergebnisse
3.1 „ Leaf-paint “ -Test der Tabakpflanze
3.2 Phänotypischer Vergleich zwischen nicht-transgenen und transgenen TabakPflanzen
3.3 Molekulare Charakterisierung mittels PCR
3.3.1 Charakterisierung der SOD-Gene
3.3.2 Charakterisierung der NMT-Gene
3.3.3 Charakterisierung SOD-Gene der zweiten Generation
3.3.4 Charakterisierung NMT-Gene der zweiten Generation
3.4 RT-PCR
3.5 Western-Blot/Immunfärbung
3.5.1 Western-Blot der zweiten Generation: SOD
3.6 SOD Enzyme Assay

4. Diskussion
4.1 Bar-Gen als Selektionsmarker („ Leaf-paint “ -Test)
4.2 Analyse der PCR-Ergebnisse
4.3 Analyse mittels RT-PCR
4.4 Analyse mittels Western-Blot/Immunfärbung
4.5 Analyse der Enzyme-Assay
4.6 Fazit und Ausblick

Eidesstattliche Erklärung

Danksagung

Literaturverzeichnis

Anhang

Anhang 1: Zusammenfassung der PCR-Ergebnisse und des Leaf paint-Tests der F1- Generation der transgenen Tabakpflanzen (NMT )

Anhang 2: Zusammenfassung der PCR-Ergebnisse und des Leaf paint-Tests der F1- Generation der transgenen Tabakpflanzen (SOD)

Anhang 3: Zusammenfassung der PCR-Ergebnisse und des Leaf paint-Tests der F2- Generation der transgenen Tabakpflanzen (NMT)

Anhang 4: Zusammenfassung der PCR-Ergebnisse und des Leaf paint-Tests der F2- Generation der transgenen Tabakpflanzen (SOD)

Anhang 5: PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder (A) Spectra™ Multicolor Broad Range Protein Ladder (B).

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 : Dictyocaulus viviparus

Abb. 2: Lebenzyklus von Dictyocaulus viviparus

Abb. 3: Adrenalin biosynthese

Abb. 4: SOD katalysierte Reaktion von SOD

Abb. 5: Cu/ZnSOD Kristallstruktur

Abb. 6: Die Halliwell-Asada Weg

Abb. 7: Strukturformel: (S)-Glufosinat und (R)-Glufosinat

Abb. 8: Funktional Karte der pGIIMH35s-NMT-His Vektor

Abb. 8.1 : Funktional Karte der pGIIMH35s-SOD Vektor

Abb. 9: Tabakpflanzen in Gewächshaus

Abb. 10: Nummerierungsystem der Versuchspflanzen

Abb. 11: Ergebnisse des Leaf Paint -Tests

Abb. 12: Optischer Vergleich zwischen nicht-transgenen und transgenen Tabak

Abb. 13: Agarosegel nach der Amplifikation des SOD (600 bp) und Tef1 (840 bp)- Genes mittels PCR in T1 generation

Abb.13.1: Agarosegel nach der Amplifikation des SOD (600 bp) und Tef1 (840 bp)- Genes mittels PCR in T1 generation

Abb.13.2: Agarosegel nach der Amplifikation des SOD (600 bp) und Tef1 (840 bp)- Genes mittels PCR in T1 generation

Abb.14: Agarosegel nach der Amplifikation des NMT (575 bp) und Tef1 (840 bp)- Gens mittels PCR in T1 generation

Abb. 14.1: Agarosegel nach der Amplifikation des NMT (575 bp) und Tef1 (840 bp)- Gens mittels PCR in T1 generation

Abb. 15: Agarosegel nach der Amplifikation des SOD(600 bp) und Tef1 (840 bp)- Genes der zweiten Generation mittels PCR in T2 generation

Abb. 16: Agarosegel nach der Amplifikation des NMT(575 bp) und Tef1 (840 bp)- Genes der zweiten Generation mittels PCR in T2 generation

Abb. 17: RT-PCRs von T2-Pflanzen

Abb. 18: Western-Blot hybridisiert mit einem mit Anti-His(Cterm)/AP Ab Antikörper für SOD-Proteine

Abb. 18.1: Western-Blot hybridisiert mit einem mit Anti-His(Cterm)/AP Ab Antikörper für SOD-Proteine

Abb. 19: Western-Blot hybridisiert mit einem mit Anti-His(Cterm)/AP Ab Antikörper für NMT-Proteine. B) Proben mit Coomassie gegengefärbt

Abb. 20: Western-Blot hybridisiert mit einem mit Anti-His(Cterm)/AP Ab Antikörper für SOD-Proteine der zweiten Generation und B) Proben mit Coomassie gegengefärbt

Abb. 21 : Zusammenfassung des Enzym- Assays nach der Messung bei 45 nm

Abb.21.1: Zusammenfassung der Mittelwerten von allen Proteinproben

Abb.21.2: Superoxide Dismutase Aktivität (U/mL)

Abb.22: Zusammenfassung des Enzym- Assays nach der Messung bei 45 nm

Abb.22.1: Zusammenfassung der Mittelwerten von allen Proteinproben

Abb.22.2 : Superoxide Dismutase Aktivität (U/mL)

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Impfstoffproduktion in transgenen Pflanzen

Tab. 2: PCR-Reaktionsansatz mit zwei Primerpaaren

Tab. 3: PCR-Programm

Tab. 4: Primerkombinationen für die jeweiligen Zielgene mit der Produktgröße in Multiplex-PCRs

Tab.5 : 12 % Trenngel

Tab.5.1: 12 % Sammelgel

Tab.6 : Standerd (Stn) 1 bis 7 mit Volumen der Zugabe von jedem Röhrchen

Abkürzungsverzeichnis

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Zusammenfassung

Mohammad, Hamza

Entwicklung eines “plant-based“ Impfstoffs gegen den Lungenwurm des Rindes

Gentechnisch veränderte Pflanzen, welche der Produktion von industriellen Stoffen oder Pharmazeutika statt der Futtermittel- und Nahrungsproduktion dienen, werden heutzutage als Pharma-Pflanzen bezeichnet. Aufgrund der gentechnischen Veränderung produzieren diese Pharma-Pflanzen Impfstoffe oder Antikörper für den Pharma-Bereich bzw. Enzyme für unterschiedliche Pharma-Zweige. Um diese Enzyme herzustellen, werden unter anderem Gene verschiedener Tierarten oder Pflanzenarten unter Verwendung von molekularbiologischen Methoden in das Genom von Nahrungspflanzen eingebaut. Der Lungenwurm Dictyocaulus viviparus ist in den gemäßigten Klimazonen wie z.B. Norddeutschland einer der wirtschaftlich bedeutsamsten Parasiten des Rindes. Diese Parasiten verursachen eine parasitäre Bronchitis-Erkrankung, welche in unterschiedlichen Graden auftreten und sogar in einigen Fällen zum Tod der infizierten Tiere führen kann.

Um eine Lungenwurminfektion zu bekämpfen konnten Anthelminthika und sogar in einigen Ländern Lebendvakzine aus röntgenattenuierten Larven sowie weidetechnische Maßnahmen eingesetzt werden. Unter Verwendung dieser Vakzine kann aber nur für ein paar Monate eine belastbare Immunität der Rinder induziert werden. Außerdem ist die Produktion dieser Vakzine mit sehr hohen Kosten und begrenzter Haltbarkeit verbunden. Deswegen wurde in dieser Arbeit versucht, rekombinante Proteine in hoher Reinheit und großer Menge in Tabakpflanzen herzustellen und diese Proteine, welche durch biotechnologische Verfahren produziert wurden, statt der bisherigen Immunisierungsmöglichkeit als Vakzine bei entsprechender Effizienz einzusetzen.

Zuerst wurden die Vektoren mit SOD (Superoxid Dismutase) und NMT (N- Methyltransferase) konstruiert (pGIIMH35S-NMT-HIS Vektor ca. 6322 bp und pGIIMH35S-SOD Vektor ca. 6138 bp) (IPG,Hassan). Die Impfstoffkandidaten SOD und NMT zeigten bei E. coli eine toxische Wirkung. Deswegen wurden sie mit Agrobacterium tumefaciens in die Tabakpflanze transformiert. Der Weg zur Impfstoffentwicklung begann mit der Überprüfung der Transformation:Die transformierte Tabakpflanze enthält als selektierbaren Marker ein Bar-Gen, welches die transgenen Pflanzen gegen das Herbizid Basta resistent macht, weshalb diese Pflanzen eine Behandlung mit Basta überleben. Es folgte der Nachweis der entsprechenden Gensequenzen im Genom der Tabakpflanze. An den Pflanzen, welche die erwünschten Gene schon integriert hatten, wurden dann die rekombinant exprimierten Proteine durch Westen-Blot nachgewiesen und ihre Enzymaktivität wurde gemessen. Bei allen Tabakpflanzen, denen schon eine akzeptable Enzymaktivität nachgewiesen werden konnte, wurden die Samen geernet und für weitere Arbeiten und Experimente aufbewahrt.

Schlagwörter: Tabak, Impfstoff, Dictyocaulus viviparus, Rind, SOD (Superoxid dismutase), NMT (N-Methyltransferase).

Abstract

Mohammad, Hamza

Development of a "plant-based" vaccine against lungworm of cattle

Genetically modified plants, which are used in the production of industrial materials or pharmaceuticals instead of feed and food production, are nowadays referred to as pharmaceutical plants. Due to genetic modification, these pharmaceutical plants produce important proteins (vaccines or antibodies) for pharmaceutical use as enzymes for different applications. In order to produce these proteins/enzymes the coding DNA are incorporated into the genome of plant where the plants will express the protein to high level producing low cost molecules compared with other expression systems like cell culture, hypridoma, fermentas. As well as, when the target proteins has a lethal effect on E.coli hindering the overexpression. In temperate climates such as Northern Germany the lungworm (Dictyocaulus viviparous) is one of the economically most important parasites of cattle. This parasite causes parasitic bronchitis disease, which occurs in varying intensity and-in some cases-can lead to death of the infected animals.

It was possible to control a lung worm infection with anthelmintics and even in some countries with a live vaccine, which consists of X-ray attenuated larvae and pasturage technical measures. This vaccine can only induce a robust immunity in cattle for a few months. In addition, the production of these vaccines is very costly and suffers from limited durability. Therefore, an attempt was made in this work to produce recombinant proteins in high purity and in large amounts by using tobacco plants and to use these proteins instead of the previously available immunization as a vaccine with high efficiency.

First, the vectors were constructed harbouring SOD (superoxide dismutase pGIIMH35S-SOD vector size approximately 6138 bp). and NMT (N-methyl) (pGIIMH35S NMT-HIS vector size approximately 6322 bp) since expression of SOD and NMT showed a toxic effect in E. coli, alternative system is needed like plant based expression. Therefore, they were genetically transfered into tobacco plants using Agrobacterium tumefaciens mediated transformation. Different molecular biology methods were used to confirm the integration of the genes into gDNA of tobacco like PCR and RT-PCR using different sets of primers at DNA and RNA level and functional assays using Basta herbicide and enzymatic assys at protein level. The desired proteins were detected by western blot and their enzyme activity was measured. Many tobacco plants were tested and proved the expression at acceptable enzyme activity, the seeds of different clones were harvested and stored for further use and experiments.

Keywords: Tobacco, vaccine, Dictyocaulus viviparous, cattle, SOD (superoxide dismutase), NMT (N-methyltransferase).

1. Einleitung

1.1 Impfstoffe

Impfstoffe induziern Immunität gegen Krankheiten, indem sie den Körper anregen, die passenden Antikörper gegen Krankheiten zu erzeugen. Sie sind auch als Antigene bekannt. Die meisten Stoffe werden per Injektion oder oral appliziert, jedoch erfolgt im zweiten Fall meist eine niedrigere Immunreaktion (Giddings et al., 2001; Freese, 2002). Im Fall oral einnehmbarer Impfstoffe müssten Pflanzen gentechnisch so konstruiert werden, dass sie die erwünschten Stoffe in direkt essbaren Pflanzenorganen produzieren und Impfungen per Injektion dadurch unnötig machen. Insbesondere im Hinblick auf wirtschaftlich unterentwickelte Länder in Lateinamerika, Afrika und Asien, in denen es an Hygiene und Lagermöglichkeiten mangelt, sollte ein Großteil der Bevölkerung auf diese Art und Weise Impfschutz vor Tollwut, Hepatitis oder Malaria erhalten. Darüber hinaus könnten hohe Kosten für die Extraktion der Stoffe eingespart werden (Freese, 2002; Ma et al., 2003). Als eines der wichtigsten Probleme in diesem Prozess erwies sich, dass die erwünschten Stoffe in den Pflanzen in völlig unterschiedlichen Konzentrationen gebildet wurden, was die gebotene exakte Dosierung unmöglich machte. Deshalb setzte die Forschung zum großen Teil an direkt konsumierbaren Impfstoffen an. Dazu gehören Impfstoffe gegen Tollwut, gegen die Krebsform Non-Hodkin-Lymphom (NHL), Cholera, Malaria, Diarrhoe (Norwalk virus), Grippe, Hepatitis B und HIV-Virus sowie gp 120, welches zur Behandlung von AIDS verwendet werden soll (Tabelle 1). Im Bereich der Veterinärmedizin wurde auch ein Impfstoff gegen die Maul- und Klauenseuche und eine Durchfallerkrankung bei Schweinen (TGEV) entwickelt (Freese, 2002).

Tab. 1: Impfstoffproduktion in transgenen Pflanzen (Giddings et al., 2001; Freese, 2002; Ma et al., 2003)

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1.2 Gentechnik in der Pharmazeutikaherstellung

Gentechnische Verfahren gewinnen bei der Produktion industrieller Chemikalien an Bedeutung. Mit gentechnischen Methoden können z.B., im Gegensatz zu synthetischen Pharmazeutika, Stoffe in lebenden Organismen produziert werden („Biologics“), da diese Organismen leicht veränderbar sind. Dagegen müssen traditionelle pharmazeutische Stoffe synthetisch hergestellt werden (Freese, 2002).

Gentechnik verändert das Erbgut eines Organismus unter Verwendung von Techniken, die entweder vererbbares Material entfernen oder solches Erbmaterial in die DNA einführen, das außerhalb des Organismus entwickelt wurde. Entweder wird es direkt in den Wirt eingepflanzt oder in eine Zelle, die dann mit dem Wirt fusioniert oder hybridisiert wird (Union 2001). Solche Methoden wurden erst durch die Entdeckung von Restriktionsenzymen ermöglicht. Diese Enzyme sind in der Lage aus einem DNA-Strang genau definierte und festgelegte Teilstücke herauszuschneiden, die danach mit Hilfe der Ligasen (DNA-Stränge verknüpfende Enzyme) wieder mit einem anderen Molekül an einer anderen Stelle verknüpft werden (Richard J. Roberts, 1976). Heutzutage gibt es für die Transformation Viele Methoden in der Gentechnik, die die direkte Aufnahme von DNA-Molekülen ermöglichen z.B. Mikroinjektion, die Elektroporation (kurzfristige Erhöhung der Permeabilität von Biomembranen durch elektrische Impulse) oder eine Genkanone, die DNA mit Hilfe von Partikeln in Zellen schießt (Sanford, 1990).

Gentechnisch veränderte Organismen (GVO) oder auch transgene Organismen, sind Tiere oder Pflanzen, deren Erbanlagen mittels gentechnischer Verfahren gezielt verändert sind, sodass sie Gene enthalten, das aus einem fremden Organismus entnommen wurde (Carlos Popelka, Terryn et al. 2004).Diese neuen Möglichkeiten und Techniken wurden schon seit langem für die Entwicklung neuartiger Nutzpflanzen eingesetzt (M. J. Crawley 2001). Die erste Entwicklung einer gentechnisch modifizierten Pflanze gelang schon 1983 (Herrera-Estrella et al.,1983). Dabei handelte es sich um eine Tabakpflanze. Heutezutage gibt es gentechnisch veränderte Sorten von fast allen Kulturpflanzen wie z.B. Raps, Soja, Mais, Kartoffeln, Baumwolle und natürlich auch Tabak (TransGEN 2013).

Die Transformation in der Tabakpflanze wurde mittels Agrobacterium tumefaciens durchgeführt. Diese Bakterien enthalten Ti-Plasmid (Ti steht für Tumor induzierend). Die Gene gelangen bei einer Infektion der T-DNA in die Pflanzenzelle und werden nachher ins Pflanzengenom intergriert. Durch sekundäre Pflanzenstoffe wie z.B. Phenolische Verbindungen, Isoprenoide Verbindungen, Alkaloide und Aminosäuren wird die Transkription dieser vir-Gene aktiviert. Mithilfe dieser Technik wird Genen Fremd-DNA, meistens Selektions- oder Markergene, einkloniert, die bei der Selektion der transformierten Pflanze helfen. Das Prinzip des Gen-Transfers von A. tumefaciens ist in “Gentechnik bei Pflanzen“ (Kempken und Kempken, 2004) beschrieben.

1.3 Die Dictyokaulose des Rindes

1.3.1 Erreger

Dictyocaulus viviparus, der große Lungenwurm des Rindes, wurde erstmals 1782 von Bloch beschrieben (Abb.1). D. viviparus wurde als Nematode in der Ordnung Rhabditina und der Familie Trichostrongylidae sowie mit Dictyocaulinae als Unterfamilie zugeordnt. Als adulter Wurm parasitiert er in der Trachea und den Bronchien von einigen Wildwiederkäuern und Rindern und er ist der Hauptverursacher der parasitären Bronchopneumonie (Enigk u. Hildebrandt,1969; Presidente et al., 1972).

Neben D. viviparus gehören auch weitere Arten, wie z.B. D. arnfieldi, D. filaria, D. capreolus und D. eckerti der Unterfamilie Dictyocaulinae an, welche ein anderes Wirtsspektrum besitzen. D. filaria parasitiert auf kleinen Wiederkäuern als Wirten, während D. arnfieldi bei Eseln und Pferden beschrieben wurde (Gothe u. Kandels 1984; Hasslinger 1989). D. capreolus wurde erst kürzlich ausschließlich bei Rotwild und Elchen nachgewiesen, demgegenüber konnte D. eckerti an Wildwiederkäuerarten bei einer größeren Anzahl aufgefunden (Enigk u. Hildebrandt 1969; Divina et al., 2002; Höglund et al., 2003b). Durch die Etablierung molekularbiologischer Methoden wurde bestätigt, dass die beiden letztgenannten Spezies eigenständige Arten sind (Epe et al. 1997; Höglund et al. 1999; Gibbons u. Höglund 2002)

Einige Lungenwurmspezies können an mehreren Wirtstierarten parasitieren, zeigen aber nicht die gleiche ausgeprägte Anpassungsfähigkeit an unterschiedlichen Wirtstierarten. Eine patente Infektion, die durch D. arnfieldi ausgebildet wurde, kommt seltner beim Pferd als beim Esel vor (Hasslinger, 1989; Urquhart et al., 1996), dasselbe ist der Fall beim Rind, da es als Wildwiederkäuer empfänglicher für D. viviparus ist (Kutzer, 1988; Holtum, 2006).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb 1: Dictyocaulus viviparus, Larvenstadien, Vergrößerung 100x:

A) erste Larve, B) dritte Larve (Holtum, 2006)

1.3.2 Lebenszyklus

Die Larven des Großen Lungenwurms (Dictyocaulus viviparus) werden von Rindern beim Grasen aufgenommen. Zuerst wandern die Larven vom Darm zur Lunge und erreichen nach acht bis neun Tagen die Bronchien. Dort entwickeln sie sich innerhalb von zwei Wochen zu adulten Würmern und legen ihre Eier. Die neuen Larven können wiederum schon in der Lunge aus den Eiern schlüpfen. Eier und Larven werden dann über das Flimmerepithel von der Lunge zum Mund des Rindes transportiert und schließlich in den Magen verschluckt. Die restlichen Larven werden während ihrer Passage aus den Eiern durch den Verdauungstrakt schlüpfen, weswegen nur die erste-Stufe Larven (L1) mit dem Kot an die Umgebung freigegeben werden (Taylor, 1951; Urquhart et al., 1996; Schnieder, 2006).

Die Dauer des Lebenszyklus von Dictyocaulus viviparus von der Aufnahme der infektiösen Larven (L3) auf der Weide bis zur Freigabe neuer Larven (L1) wird als Präpatenzzeit bezeichnet. Die Patenz kann eine maximale Dauer von zwei Monaten haben, während die Präpatenzzeit 21 bis 25 Tage beträgt (Jarrett et al., 1957; Urquhart et al., 1996; Schnieder, 2006). Nach vier Tagen auf der Weide bei Temperaturen über 16 °C entwickeln sich die infektiösen Larven (L3) aus den Larven

(L1) (Schnieder 2006; Taylor 1951; Urquhart et al. 1996). Die Larven nehmen über den ganzen Zeitraum außerhalb des Wirtstieres keine Nahrung zu sich, da der Stoffwechsel über die Energiereserven der L1 in der Granula betrieben wird (Taylor, 1951; Pfeiffer u. Supperer, 1980; Urquhart et al., 1996).

Bei Temperaturen unter 8°C kann eine zeitweilige Verlangsamung oder sogar Unterbrechung der Entwicklung zum geschlechtsreifen Wurm im frühen präadulten Stadium im Wirtstier beobachtet werden (Pfeiffer, 1976; Barth u. Preston, 1987). Dieses Phänomen wird als Hypobiose bezeichnet und ist auch bei anderen Nematoden bekannt. Es dient vor allem der Überwinterung der Larven. Die Fähigkeit der Larven auf der Weide zu überwintern spielt eine wesentliche Rolle bei der Fortsetzung des Infektionsgeschehens über einen langen Zeitraum. Dies konnte mehrmals unter passenden klimatischen Bedingungen nachgewiesen werden (Jarrett et al., 1955; Pfeiffer u. Supperer, 1980; Schnieder, 2006). Da die Larven aufgrund der ungerichteten Bewegung und der geringen Energiereserven nicht in der Lage sind !

sich alleine über die umgebende Vegetation zu verbreiten, wird ihre Verbreitung mit Hilfe von belebten Vektoren wie z.B. Vögeln, Käfern, oder durch koprophile Pilze (Pilobolus spp.) oder mechanische Faktoren wie z.B Regen erledigt, sodass sich L3 nach einigen Tagen einige Meter auf der Weide verbreitet haben (Doncaster, 1981; Jorgensen et al., 1982; Schnieder, 2006 ).

Innerhalb einer Woche sind große Mengen infektiöser Larven auf dem Grünland vorhanden. Auf der Weide überleben die Lungenwürmer L3 besser als die L3 der Magen-Darm-Würmer. Nach zwei Wochen auf der Weide sind ca. 90 Prozent der L3 in durchschnittlichen deutschen Sommern abgestorben und fast alle sind nach einem Monat abgestorben (Schnieder, 2006). Vereinzelte L3 können zwar auch auf dem Grünland in Norddeutschland und anderen Gebieten, in denen atlantisches Kilma herrscht, überwintern, typischerweise sterben die Larven aber im Winter ab (Schnieder, 2006).

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Abb 2: Lebenzyklus von Dictyocaulus viviparus: (http://www.weide-parasiten.de)

1: Aufnahme von L3 beim Grasen. 2: Entwicklung von L3 zu adulten Würmern, L1 und Eier werden mit dem Kot an die Umgebung freigegeben. 3: Entwicklung die L1 auf der Weide zu L2. 4: Entwicklung die L2 auf der Weide zu L3. 5: Verbreitung mit hilfe von koprophile Pilze (Pilobolus spp.). "

1.3.3 Klinik und Krankheitsverlauf

Der Krankheitsverlauf der Dictyokaulose wurde von Urquhart et al. (1996) in vier Phasen eingeteilt. Diese Gliederung der Erkrankung beginnt mit einer Penetrationsphase, welche die Phasen der Postpatenz, Patenz und Präpatenz mit unterschiedlichen pathologischen und klinischen Befunden beinhaltet (Holtum, 2006).

Bei den erkrankten Rindern konnten eine erhöhte Atemfrequenz, Husten und Fieber festgestellt werden und bei schwer erkrankten Fällen konnte sogar das typische Erscheinungsbild der Dyspnoe beobachtet werden (Michel u. Shand, 1955; Jarrett et al., 1957; Düwel, 1971). Um die Atmung zu erleichtern, stehen die erkrankten Kälber mit gestrecktem Hals und ziehen die Luft durch das Maul ein, wobei die Zunge aus dem Maul heraus gestreckt wird (Abb. 4). Dabei ist die Atemfrequenz bis auf das zwei- bis dreifache erhöht (mehr als 40 Züge/Min) (Schnieder, 2006). Ein deutlicher Gewichtsverlust konnte bei Tieren beobachtet werden und im Fall von Milchkühen kann eine Verringerung der Milchleistung auftreten (Michel u. Shand, 1955; Lekeux et al., 1985). Nasenausfluss und Fieber zeigen an, dass sich vielleicht zusätzlich Bakterien oder Viren in der Lunge des Rindes angesiedelt haben, es kann also zu einer Sekundärinfektion führen (Urquhart et al., 1996).

1.3.4 Diagnose

Die Krankheit wurde hauptsächlich durch die charakteristischen klinischen Symptome, die in der Weidezeit bei den Tieren beobachtet werden können, diagnostiziert. Wenn die erstsömmrigen Rinder in einer Herde ca. zwei bis drei Wochen nach dem Austrieb Krankheitssymptome wie Tachypnoe oder Husten zeigen, sollte an Dictyokaulose gedacht werden, besonders wenn die Herden in der Region schon mal mit D.viviparus infiziert waren (Taylor, 1951; Jarrett et al., 1957; Pfeiffer u. Supperer 1980). Meist ist eine parasitäre Bronchitis die Ursache, wenn Kälber auf der Weide husten. Laut Jarrett et al. (1957) handelt es sich auch um ein pathognomonisches Krankheitsbild, wenn die Beobachtung nicht alle Rinder der Gruppe trifft, sondern nur einige von ihnen krank zu sein scheinen (Holtum, 2006). Der Zeitpunkt des Auftretens ist ein weiterer Hinweis dafür. Eine patente Lungenwurminfektion kann mittels des Auswanderungsverfahrens bestätigt werden, bei dem die ersten Larven, die aus dem Kot ausgeschieden wurden, nachgewiesen werden (Baermann, 1917). In den Phasen der Prä- und Postpatenz kann dieser direkte Infektionsnachweis nicht durchgeführt werden, weil in diesen Phasen keine Larven aus dem Kot ausgeschieden werden. Normalerweise treten die meisten Ausbrüche parasitärer Bronchitis ab Anfang August auf, also in der zweiten Hälfte der Weidesaison. Durch Kotuntersuchungen kann die Diagnose einer patenten Infektion bestätigt werden. Die L1 der Lungenwürmer können nach Anzüchtung aus frischem Rinderdung im Labor nachgewiesen werden (Heinrich, 2001).

1.3.5 Immunität und Vorbeugung

Einerseits entwickeln sich die Lungenwurmlarven (L1-L3) auf der Weide sehr schnell, andererseits verbreiten sich die infektiösen Larven über das Grünland sehr effektiv. Deswegen existieren kaum effektive Strategien zum Weidemanagement, um eine einmal aufgetauchte Infektion zurückzudrängen (Heinrich, 2001). Schnieder (2006) beschreibt folgende weidetechnischen Maßnahmen zur Vorbeugung gegen D.viviparus:

1. Auf der Weide überwinternde Larven werden absterben gelassen indem die Kälber erst spät ausgetrieben werden.
2. Potentielle Ausscheider werden von Kälbern getrennt.
3. Die empfänglichen (erstsömmrigen) Rinder werden täglich kontrolliert.
4. Die Kälber werden nicht auf Flächen grasen gelassen, auf denen im selben Jahr schon Ausscheider waren.
5. Beim Weidewechsel wird darauf geachtet, dass vorher sechs Wochen lang keine anderen Rinder auf der Weide gegrast haben.

Gegen die Lungenwürmer wirken die meisten Anthelminthika, die normalerweise gegen MDS wirken. Die Verwendung von Langzeitanthelminthika über die ganze Weidezeit bietet zwar Schutz vor Lungenwurmkrankheiten, dann sind die Rinder aber nicht mehr fähig ihre eigene Immunität gegen Lungenwürmer zu entwicklen (Schnieder, 2006). Nach einer Erstinfektion mit der Dictyokaulose der Rinder führen die Immunreaktionen zu einer protektiven Immunität (Jarrett et al., 1957). Daher sind insbesondere erstsömmrige Tiere von einer Lungenwurminfektion betroffen. Tiere, die keinen kontinuierlichen, wiederholten Reinfektionen mit D. viviparus ausgesetzt sind, werden nach einiger Zeit wieder empfänglich, was erneut eine patente Erkrankung mit klaren klinischen Symptomen bei den zweitsömmerigen Rindern auftreten lassen kann (Michel, 1958; Holtum, 2006). Falls in der letztendlichen Entscheidung eine Entwurmung gegen MDS empfohlen wird, sollten die Lungenwürmer miterfasst werden. Da allerdings nur die Kälber behandelt werden, bleiben die Kühe als potentielle Hauptausscheider. Sie können das Grünland signifikant mit Lungenwurmlarven kontaminieren ( Schnieder, 2006; Heinrich, 2011).

Bei der Lungenwurminfektion dienen stadienspezifisch unterschiedliche Komponenten der Nematoden als antigene Strukturen. Eine Bindung der Immunglobuline konnte bei den dritten Larven (L3) sowohl an der Kutikula, die nach der Entscheidung der Larven bemerkbar ist, als auch an der Scheide beobachtet werden (Gilleard et al., 1995; Mckeand et al., 1996).

1.3.6 Entwicklung eines Impfstoffes gegen den Lungenwurm des Rindes

Die Expression der Gene ist abhängig vom Lebensstadium des Nematoden, also auch vom Aufenthaltsort im Wirt, vom Geschlecht und vielen weiteren Faktoren. Daher hat jede Generation ihr spezielles Proteom und Antigenmuster. Verschiedene Stadien lösen unterschiedliche Immunreaktionen beim Wirt aus und haben zudem eine negative Wirkung auf andere Generationen der Parasiten. Es ist also möglich, durch die richtigen Isoforme, der im E/S-Produkt von D. viviparus befindlichen Proteine einen Impfstoff zu entwickeln, was derzeit versucht wird.

1.4 Phenylethanolamin-N-Methyltransferasen (PNMT)

Methylasen oder Methyltransferasen sind Enzyme, die ihre Substrate in allen Lebewesen methylieren. Das bedeutet, dass sie eine Methylgruppe auf andere Biomoleküle übertragen können (Abb. 3). Diese Reaktion spielt eine wichtige Rolle bei ganz unterschiedlichen Stoffwechselwegen, wie z.B bei der Biosynthese der Cobalamine, Methionin und dTTP, Menachinone, von Porphyrin. Neben diversen Synthesewegen spielen Methyltransferasen generell beim Prozessieren von genetischer Information eine sehr wichtige Rolle: bei der Modifizierung von tRNA und des mRNA-Capping und bei der Behandlung von ribosomaler RNA; bei anderen Methoden der Regulation der Transkription wie der DNA-Methylierung (Clancy, Shambaugh et al. 2002).

Phenylethanolamin-N-Methyltransferasen (PNMT) ist eine Art von ubiquitär Transferaseenzym, welches in Nematoden wie auch in anderen Vertebraten die Umwandlung von Noradrenalin in den Neurotransmitter Adrenalin unter Verwendung von S-Adenosylmethionin als Co-Substrat und Methyldonor katalysieren (Kisiel et al., 1976; Frandsen u. Bone 1988; Smart, 1988) (Abb.3) (Wong 2006). Die PNMT findet bei Nematoden in den adrenergen Neuronen des Kopfes statt (Goh u. Davey, 1985; Lee u. Ko, 1991; Strube, 2004;). Es wurde vermutet, dass der Neurotransmitter Noradrenalin eine wesentliche Rolle bei der Häutung der Parasitenstadien spielt (Rogers u. Head, 1972; Goh u. Davey, 1985; Brownlee et al., 2000). Ähnlich der Funktion von Adrenalin und Serotonin sowie Catecholamine, wird ein Einfluss von Noradrenalin auf die Kontrolle der Entwicklung und Reproduktion des Kohlenhydratmetabolismus sowie auf die Bewegung und die Nahrungsaufnahme angenommen, dagegen sind ihre Funktion bei den Signalwegen bislang nicht geklärt (Smart, 1989; Strube, 2004).

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Abb 3: Adrenalinbiosynthese. Phenylethanolamine N-Methyltransferase (PNMT), das letzte Enzym im Catecholamin-Biosyntheseweg, produziert Adrenalin aus Noradrenalin unter Verwendung von S-Adenosylmethionin als Co-Substrat und Methyldonor (Wong 2006).

Catecholamin ist an den physiologischen Veränderungen beteiligt, die sich bei der Entwicklung von (L3) infektiösen Larve besonders im frühen parasitären Stadium vollziehen (Rogers u. Head, 1972). Die Produktion von der PNMTase wird durch neurologische und hormonelle Stimuli wie z.B. Stress kontrolliert. Allerdings müssen angemessene Änderungen in PNMT enzymatische Aktivität nicht auftreten, was darauf hinweist, dass die post-transkriptionelle regulatorische Kontrolle der Enzym- Expression zusätzliche Einschränkungen auferlegen und es kann möglich sein, dass die letztere einige Änderungen in der PNMT-Proteinstabilität enthält (Evinger et al., 2005; Wong, 2006).

Das Adrenalin, welches von PNMT und seine katalytische Aktivität synthetisiert, spielt möglicherweise eine wesentliche Rolle bei der Katalysierung der Entwicklungshemmung. Darüber hinaus wird damit die Stoffwechsellage der D. viviparus-Larven verändert (Croll, 1975). Die von PNMT synthetisierten Proteine, welche in Parasit-Wirt-Interaktionen involviert oder funktional an der Zellteilung und - differenzierung, der Signalregistrierung und -transduktion, dem Metabolismus und der Lokomotion sowie der Regulation der Transkription beteiligt sind, können in vielen Fällen mit der inhibierten bzw. nicht inhibierten Entwicklung in Verbindung gebracht werden (Strube, 2004).

1.5 Superoxid-Dismutase (SOD)

im Jahr 1938 wurde SOD erstmal vom Rinderblut isoliert und es wurde ursprünglich davon ausgegangen, dass SOD an der Kupfereinlagerung beteiligt ist. Es wurde ursprünglich als Tetrazoliumoxidase, Erythrocuprein und Indophenoloxidase bezeichnet bis zur Entdeckung seiner katalytischen Funktion (McCord und Fridovich, 1969; Bowler et al., 1992).

Die Bedeutung von SOD liegt in der Aktivität der Enzyme, die mit Superoxid-Anionen (O2−) in einer Disproportionierungsreaktion reagiert. Erstens reagiert die oxidierte Form des Enzyms mit einem Superoxidion und führt zu Bildung der reduzierten Form des Enzyms und Sauerstoff. Zweitens reagiert diese Form weiter mit einem anderen Superoxidion und zwei Protonen, dabei entsteht die oxidierte Form des Enzyms und Wasserstoffperoxid.

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Abb 4: SOD-katalysierte Reaktion zeigt die Bildung von Wasserstoffperoxid (H2O2) und Wasserstoff (O2) aus Superoxid-Anionen (O2−)

Von dem dabei gebildeten Wasserstoffperoxid reagieren zwei Moleküle weiter zu zwei Molekülen Wasser und einem Molekül Sauerstoff. Das Enzym Katalase wird diese Reaktion katalysieren. In Pflanzen ist diese Reaktion konstitutiv, obwohl sie in einer sehr geringen Rate auftritt. Sie kann aber bei beschleunigten Ebenen katalysiert wird und ist somit eine wichtige Verteidigungslinie in Zeiten von Stress, in denen ROS-Ebenen deutlich erhöht sind (Dalton, 1995; Prasad, 2004; Corpas et al., 2006).

SOD-Superoxiddismutase existiert in drei leicht unterscheidbaren Gruppen, die vom Metall-Co-Faktor abhängig sind: Mangan-enthaltende SOD, eisenhaltige SOD und Kupfer-/Zink-enthaltende SOD (Abb. 5). Letztere Form kommt im Zytoplasma aller Eukaryoten vor und in manchen Eukaryoten als extrazelluläre Form; in Prokaryoten als eine periplasmatische Form (Van Campa et al., 1997; Morgan et al., 2008).

Dagegen wurde MnSOD in den Mitochondrien und FeSOD in Chloroplasten gefunden. Gleichzeitig konnte MnSOD auch in Chloroplasten nachgewiesen werden (Bowler et al., 1992). Diese Drei Klassen von SOD-Superoxiddismutase wurden auch in Tabakpflanzen gefunden (Bannister et al., 1987; Van Campa et al., 1997). Die SOD-Isoformen in Tabak sind alle kerncodiert, aber die Gen-Produkte sind in verschiedenen subzellulären Kompartimenten lokalisiert (Tsang, Bowler et al. 1991).

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Abb 5: Cu/ZnSOD Kristallstruktur: Es existiert als Dimer mit zwei identischen Untereinheiten. Jede Untereinheit enthält ein Zn-Atom (blau) und Cu-Atom (Red). (Strange et al., 2007).

In Pflanzen sind die eisenhaltigen SOD in den Chloroplasten lokalisiert und die MnSOD in Mitochondrien und Peroxisomen. Alle SOD-Formen sind nuklear mit N- terminalen Sequenzen kodiert, die den Transport zu verschiedenen Organellen leiten können, aber nur die FeSOD- und MnSOD-Enzyme sind strukturell ähnlich. Cu- und ZnSOD sind strukturell nicht mit ersteren verwandt (Bowler et al., 1992). Alle SOD- Isoformen können unter Verwendung von Elektrophorese und aufgrund ihrer Metall- Co-Faktoren und relativen Molekülmassen isoliert und detektiert werden (Dalton, 1995; Prasad 2004).

Weiterhin ist die Verwendung von speziellen Inhibitoren zur einfachen Detektion als spezifische Isoenzymaktivität, wie Cyanid (KCN) und H2O2, die unterschiedlich mit jeder Form reagieren, möglich. Cu-/ ZnSOD ist empfindlich für die beiden Behandlungen, MnSOD ist resistent gegen die beiden, und FeSOD ist nur bei H2O2 empfindlich (Del Rio et al., 1985; Bowler et al., 1992; Murao et al., 2004).

Die beiden FeSOD und MnSOD sind in Pflanzen strukturell ähnlich und haben einander chemisch ähnliche Eigenschaften, während die Sequenzdaten nahelegen, dass die drei Arten von SOD zu unterschiedlichen phylogenetischen Familien gehören (Gregory, 2009). Es wird angenommen, dass FeSDO und MnSOD sich von einem gemeinsamen Vorfahren entwickelt haben, während Cu- / ZnSOD sich vor kurzem und unabhängig entwickelt haben (Bowler et al.,1992; Prasad., 2004; Murao et al., 2004; Corpas et al., 2006).

Aufgrund der Bedeutung der SOD in aeroben Organismen wurde eine Reihe von Aspekten analysiert, unter anderem die biochemischen und molekularen Eigenschaften, Struktur, Expression und phylogenetische Verteilung (Corpas et al. 2006). Dalton (1990) and Gomes-Junior et al (2006) haben die Struktur und die Masse jedes Isoforms dokumentiert. Cu- / ZnSODs wurden aus Pisum, Phaseolus und Zea isoliert, die als ein Dimer mit einer Molekularmasse von 31-33 KD existieren und MnSOD als Tetramer mit einer Molekularmasse von 90 KD (Dalton, 1995; Gomes-Junior et al., 2006).

Weitere Analysen zum Anteil der einzelnen SOD im Pflanzengewebe wurde am Beispiel der Olive (Olea europaea) durchgeführt (Corpas et al., 2006). Alle drei Isoenzyme wurden mittels Expressionsanalyse charakterisiert und zeigen Cu-/ ZnSOD, FeSOD und MnSOD Ergebnisse mit 82, 17 und 0,8 % der SOD-Expression, die jeweils in ganzen Blättern analysiert wurden. Es war aber unklar, ob ein bestimmtes Gen pro Isoform für dieses exprimierte Verhältnis verantwortlich ist. Dieses Ergebnis wird auch häufig in anderen Pflanzen beobachtet, wo Cu- / ZnSOD wesentlich zur gesamten SOD-Expression in einer Reihe von Geweben beiträgt. Aber die Expression der drei Isoenzyme unterscheidet sich im Verhältnis zur Art sowie dem Alter (Corpas et al., 2006). Weitere Analysen haben gezeigt, dass die Proportionen der Isozyme im Zellgewebe unterschiedlich sind, d.h. FeSOD kommt am häufigsten in Palisaden-Mesophyllzellen vor (Corpas et al., 2006).

Forschungsprojekte wie Corpas et al (2006) haben Einblicke in die Komplexität der SOD-Genfamilie und ihre evolutionäre Natur ermöglicht. Je nach Pflanzenart, Umgebungsbedingungen und Pflanzenalter kann das Spektrum der Isoenzyme und die Anzahl der kodierenden Gene je Isoenzym unterschiedlich sein. Zum Beispiel haben Sonnenblumen nur eine Isoform, ein Cu/ZnSOD, während in Arabidopsis thaliana bis zu acht SOD-Gene, alle drei Formen von SOD umfassend, identifiziert wurden. Dies zeigt die Vielfalt, die produziert werden kann (Corpas et al., 2006; Morgan et al., 2008).

Die wichtigsten ROS-abfangenden Enzyme, die an dem Antioxidans-Biosyntheseweg der Pflanzen beteiligt sind, sind Superoxid-Dismutase (SOD), Katalase (CAT), Guajacol Peroxidase (GOPX) Dehydroascorbate Reduktase (GR), monodehydrateascorbate Reduktase (MDHAR), Glutathionreduktase (GR) und Glutathionperoxidase (GPX) (Boscolo et al., 2003; Kuo& Kao., 2003; Polesskaya et al., 2004). Diese Enzyme kombinieren mit den nicht-enzymatischen Komponenten, um ROS unter Verwendung von Ascorbat, reduziertem Glutathion und NADPH als Elektronendonoren zu Sauerstoff und Wasser zu entgiften (Gupta et al., 1993; Ezaki et al., 2004). ROS durchläuft eine Reihe von Oxidations- / Reduktions-Reaktionen, die als Halliwell-Asada Weg bekannt sind. (Abb.6) (Halliwell, 2009).

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Abb 6: Der Halliwell-Asada Weg: beschreibt Komponenten des antioxidativen Wegs, die gemeinsam katalysiert werden (Halliwell, 2009).

SOD ist vor allem die erste Linie der Verteidigung bei der Entgiftung des Superoxidanion (O2−). Es wird durch Umwandlung in Wasserstoffperoxid (H2O2) und Sauerstoff in der Reaktion entfernt (Abb. 6).

1.6 Phosphinothricin (BASTA®)

Bialaphos ist ein Tripeptid Antibiotikum und wird natürlicherweise durch einige Bodenbakterien der Gattung Streptomyces wie Streptomyces hygroscopicus und Streptomyces viridochromogenes produziert (Murakami et al., 1986). Es ist ein Tripeptid bestehend aus zwei Alaninresten und Glutaminsäure-analogem Phosphinothricin, das auch Glufosinate genannt wird (Abb.7, Greifenberg, 1999). Phosphinothricin kommt in verschiedenen kommerziellen Herbiziden als Bestandteil vor und wird als Herbizid mit teilsystemischer Wirkung und Totalkontakt verwendet. Basta® ist einer der bekanntesten Handelsnamen dieser Herbizidgruppe. Glufosinat wirkt nicht nur gegen zweikeimblättrige, sondern auch gegen einkeimblättrige Pflanzen. Die Aufnahme geschieht hauptsächlich über die grünen Pflanzenteile wie die Blätter und nicht über die Wurzeln.

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Abb 7: Strukturformel: (S)-Glufosinat (links) und (R)-Glufosinat (rechts). (MacLachlan, 2012)

Die Peptidasen lassen in der Zelle Phosphinothricin-Verbindungen entstehen und dadurch wird einerseits die Glutamin-Synthetase gehemmt und andererseits eine Akkumulation von intrazellulärem Ammoniak im Blattgewebe der Pflanze verursacht, was dem pH ansteigen lässt und zu einem Mangel an verschiedenen Aminosäuren und Glutamin führt. Infolgedessen wird die Photosynthese gehemmt, woraufhin es es zum Chlorosen kommt, zum Absterben des Blattgewebes und letztendlich der gesamten Pflanze. Das pat-Gen aus Streptomyces viridochromogenes oder bar-Gen aus Streptomyces hygroscopicus kodieren für Enzyme, die Phosphinothricin

modifizieren und die Verbindung entgiften, zelluläre Resistenz gegen Bialaphos sowie Phosphinothricin oder Glufosinat verleihen (S. Tan March 2006).

Bialaphos ist am häufigsten in der pflanzlichen Molekularbiologie verwendet worden, um gentechnisch veränderte Zelllinien, die eines der Resistenzgene enthalten, auszuwählen. Bialaphos ist im Laufe der Zeit ein wichtiges Selektionsedikament besonders in der Hefegenetik geworden. Hefezellen, die das pat-Gen enthalten, wachsen in Gegenwart von Bialaphos und Bialaphos-Resistenz ist ein dominantes Merkmal (Zang et al., 2009). Bialaphos-Resistenz kann in Kombination mit auxotrophen Hefe-Markern sowie anderen dominanten selektierbaren Medikamenten wie Hygromycin B oder Kanamycin verwendet werden. Dominant drogenresistente Marker mit Bialaphos-Resistenz sind besonders nützlich in Studien bei wilden oder industriellen Hefestämmen, die oft prototroph für die gängigsten Hefe-Ernährungs- Marker sind. Resistenz gegen Bialaphos ist auch eine effiziente Möglichkeit, um Diploiden-Nachkommenschaft aus Kreuzungen zwischen Haploiden, denen die kompatiblen Auxotrophiemarker fehlen, zu identifizieren (Ivan Sadowski* 2008)

Zellen, die resistent gegen Bialaphos sind, haben keinen nachweisbaren Wachstumsnachteil und können deswegen in Kompetitionsexperimenten oder zur Überwachung anderer Prozesse abhängig vom metabolischen Zustand verwendet werden. Schließlich ist das pat-Gen heterolog zum Hefegenom, weshalb unangemessene Integration oder Rekombination unwahrscheinlich ist (Goldstein, 1999)

1.7 Expressionssysteme

Man bezeichnet jedes biologische System das fähig ist, kontrolliert und gezielt Proteinbiosynthese zu betreiben, als Expressionssystem. Das bedeutet, es werden nach der Vorlage einer Nukleinsäure bestimmte Proteine hergestellt, also exprimiert. Alle lebenden Zellen sind in der Lage, ein Expressionssystem darzustellen. Man unterscheidet eukaryotische und prokaryotische Expressionssysteme (Richter, 2003).

Expressionssysteme basieren auf der Insertion eines Gens für die Transkription und die Translation und damit die Expression eines Proteine in einer Wirtszelle. Diese Wirtszellen umfassen: Bakterien wie E. coli und Bacillus subtilis (B. subtilis), Hefen

(Saccharomyces, Pichia, Kluoveromyces), gezüchtete Insektenzellen mit

Baculoviren, kultivierte Säugerzellen und Pflanzenzellen als auch Viren. Die Wahl des verwendeten Zelltyps ist abhängig von dem Protein, das exprimiert werden soll und alle erfordern, dass DNA in einen geeigneten Vektor kloniert wird (Mullins 2000). Bakterienzellen werden häufig als Wirtszellen für die Expression verwendet, da sie viele Vorteile besitzen:

- Die einfache Physiologie,
- kurze Generationenfolge (Bakterien wachsen und vermehren sich rasch),
- große Ausbeuten des jeweiligen Produkts (bis zu 10% der Masse) und
- niedrige Kosten (Hellwig, S., J. Drossard, et al., 2004).

Für diese Arbeit fanden die Charakterisierung und Transformation an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover statt. Mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wurden die Vektoren pGIIMH35s-NMT-His und pGIIMH35s-SOD (IPB, Hassan Abb. 8 und 8.1) konstruiert und danach wurden sie in das Tabakgenom eingebracht.

Die Verwendung von Vektoren des Typs pGreenII bietet Vorteile gegenüber anderen Vektoren aufgrund ihrer geringeren Größe, einfacher Handhabung, multiplen Klonierungsstellen, hoher Kopienzahl und einer verbesserten Stabilität in E.coli. Unter nicht-selektiven Bedingungen ist die Anzahl der Agrobacteriumkolonien, die pGreenPlasmide enthalten, nach 24 Stunden um 50% reduziert, was zur Erhöhung der Sicherheit bei Verwendung dieses Vektors führt (Edwards et al., 2000).

Da pGreen dual ist, benötigt es die Anwesenheit des Helferplasmids pSoup im gleichen strain, um die Replikationsfunktionen in trans für pGreen bereitzustellen. Das System bietet einen weiteren Vorteil durch die Verwendung von pSoup für CoTransformation, um markerfreie transgene Pflanzen durch eine zweite T-DNA zu produzieren, die das Marker enthält, während das Gen von Interesse in pGreen existiert (Afolabi et al., 2005). Voraussetzung für diese Technik ist ein hoch effizientes Transformationsprotokoll, das einer hohen Zahl der verschiedenen transgenen Lokalisationen der beiden T-DNA dient.

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Abb 8: Funktionale Karte des pGIIMH35s-NMT-His Vektors (von IPG, Hassan). 35S-P, Doppel 35S Promotor aus CaMV; NOS-P und NOS-T, Agrobacterium Nopalin-Synthase-Promotor und Terminator beziehungsweise Bar, Herbizid-Resistenz Pflanzlicheselektionsmarker-Gen aus Streptomyces hygroscopicus (Murakami et al, 1986.); NPTi: Kanamycinresistenz als selektierbarem Marker in Bakterien; RB, rechte Border; LB, linke Border; NMT: N-Methyltransferase; His-Tag: histedin- Tag sind Aminosäuresequenzen, die bestimmte Proteine markieren können.

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Abb 8.1 : Funktionale Karte des pGIIMH35s-SOD Vektor (von IPG, Hassan). 35S-P, Doppel 35S Promotor aus CaMV; NOS-P und NOS-T, Agrobacterium Nopalin-Synthase-Promotor und Terminator beziehungsweise Bar, Herbizid-Resistenz Pflanzlicheselektionsmarker-Gen aus Streptomyces hygroscopicus (Murakami et al, 1986.); NPTi: Kanamycinresistenz als selektierbarem Marker in Bakterien; RB, rechte Border; LB, linke Border; SOD: Superoxid-Dismutase; His-Tag: histedin- Tag sind Aminosäuresequenzen,die bestimmte Proteine markieren können.

Die T-DNA von PGII MH35s enthält das fusionierte bar-Gen zwischen dem nos Promotor und Terminator-Sequenzen von Agrobacterium tumefaciens. Das bar-Gen kodiert für ein Phosphinothricinacetyltransferase (PAT) Enzym, welches die Resistenz gegenüber Bialaphos und die verwandte Verbindung Phosphinothricinacetyltransferase (PPt), Wirkstoff des Herbizids Glufosinatammonium und BASTA®, durch Acetylierung verleiht (Hashem 2007).

1.8 Konzeption der vorliegenden Arbeit

Im Sinne des Konzepts der Pharmapflanzen wurde in dieser Arbeit versucht einen Impfstoff gegen Dictyocaulus viviparus des Rindes zu entwickeln. Deswegen wurden zwei Gene (SOD, NMT) in Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum L.) transformiert, um die von diesen Genen produzierten Enzyme zu erhalten und für weitere Tests auf den Rindern bereitzustellen.

Um dieses rekombinante Protein in Tabak herzustellen, waren die spezifischen Ziele dieser Studie:

- Molekulare Charakterisierung des Impfstoffkandidaten SOD (extrazelluläre Superoxiddismutase) und NMT (N-Methyltransferase),
- funktionelle Charakterisierung von SOD und NMT transgener Tabakpflanzen unter Verwendung von Leaf Paint Assay,
- immunogene Überprüfung dieser Proteine und
- die Bestimmung der Enzymaktivität des SOD-Gens.

2. Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Geräte und Materialien

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2.1.3 Enzyme, Puffer, PCR- und DetectX® Kits Bestandteile

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2.1.4 Größenstandards

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2.1.5 Primer

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2.1.6 DetectX® Superoxide Dismutase

Das DetectX® Superoxide Dismutase (SOD) Colorimetric Activity Kit wurde entwickelt, um quantitativ die SOD-Aktivität in einer Vielzahl von Proben zu messen. Der Assay misst alle Arten von SOD-Aktivität, einschließlich der von Cu- / Zn-, Mnund FeSOD-Typen. Ein Rindererythrozyten-SOD-Standard wird bereitgestellt, um eine Standardkurve für den Assay zu generieren und alle Proben sollten aus der Standardkurve abgelesen werden.

2.2 Methoden

2.2.1 Kultur transgener Tabakpflanzen

Die Kultivierung der transgenen Tabakpflanzen sowie der Kontrollpflanzen (nicht transgene Tabakpflanzen) erfolgte in einem S1 Gewächshaus. Verwendet wurden in dieser Arbeit Pflanztöpfe mit einem Durchmesser von 14 cm. Da die Samen Lichtkeimer sind, wurden sie leicht auf ein Kultursubstrat aus Weißtorf angedrückt und nicht mit Erde bedeckt (osCommerce 2013). Nach etwa acht Tagen keimten die ersten Samen bei ca. 18 bis 20°C. Die Pflanzen wurden regelmäßig, abhängig von der Gewächshaustemperatur, bewässert. Die Belichtungsdauer betrug pro Tag 16 Stunden. Die Anwendung chemischer Bekämpfungsmittel erfolgte bei Bedarf. Nach etwa vier Wochen wurden die Tabakpflanzen mit BASTA® 600 mg/l (stock 200 g/l) behandelt und die überlebenden Pflanzen erneut in Pflanztöpfe mit einem Durchmesser von 20 cm umgetopft . Nach etwa vier Monaten bildeten sich Blüten an den Tabakpflanzen (Abb. 9B) und nach etwa fünf Monaten konnten die reifen Samen für die nächste Generation geerntet werden.

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Abb 9: A) Tabakpflanzen nach 10 Wochen im Gewächshaus. B) Tabakblüten nach vier Monaten im Gewächshaus.

2.2.2 Leaf Paint Assay

Zur funktionalen Charakterisierung transgener Tabakpflanzen wurde der Leaf Paint Assay eingesetzt. Da das verwendete Marker-Gen die BASTA®- Resistenzgene enthält, wird Glufosinat acetylisiert und kann somit nicht mehr den Ammoniak-Kreislauf stören. Hierbei wurde ein Blatt/eine Pflanze markiert und links der Mittelrippe das Herbizid BASTA® in einer Konzentration von 600 mg/l aufgetragen. Nach einer Woche folgte die Auswertung des Tests durch Überprüfung des Zustands der Blätter. Bei behandelten Pflanzen mit gelben Blättern wurde der Test als negativ (-) bewertet. Die Pflanze ist nicht transgen, weil sie keine Herbizid-Resistenz aufweist. Falls die behandelte Blattfläche keine sichtbare Wirkung zeigte, wurde der Test als positiv (+) gewertet. Danach wurden die Ergebnisse des Leaf Paint Assay mit den PCR- Ergebnissen verglichen.

2.2.3 Nomenklatur

Die Tabakpflanzen wurden in dieser Arbeit systematisch benannt. Die drei Buchstaben an erster Stellebezeichnen den Gennamen, wobei NMT für Phenylethanolamin-N-Methyltransferasen und SOD für Superoxid-Dismutase steht. Die Transformationsversuchsnummer ist an zweiter Stelle angegeben. Die Klone aus verschiedener Explantat-Herkunft stehen an dritter Stelle. Alle Pflanzen eines Klons, die schon Samen gebildet haben, bekommen eine Nummer und werden von der Klonnummer durch ein Komma getrennt. Die Anzahl der Nachkommen der vorherigen Generation wurden als weiteren Nummern nach dem Komma angegeben. Der durch Transformation entstandene Klon prägt die Generation T0. Die erste Generation (T1) wurde von den ersten Nachkommen dieses Klons gebildet. (Abb. 10).

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Abb 10: Nummerierungsystem der Versuchspflanzen. Leserichtung ist von rechts nach links: hier wurden die Klonnummer und Klongeneration gezeigt und bestimmt.

2.2.4 DNA-Isolation

2.2.4.1 Schnelle Methode

Für die DNA-Isolation gibt es mehrere Methoden, in dieser Arbeit wurde die „schnelle Methode“ von Edwards et al. (1991) verwendet. Diese Methode ist sehr effizient für die schnelle Extraktion von kleinen Mengen genomischer DNA, welche später für PCR-Analysen verwendbar ist. Ca. 100 mg Blattmaterial von jeder Pflanze wurden geerntet und in Eppendorf 1,5 ml in flüssigem Stickstoff gefroren. Danach wurde das Gewebe zerkleinert. 500 μl Extraktionspuffer wurden zugegeben und die Proben wurden eine Minute lang bei Raumtemperatur kräftig durchgemischt. Die Proben wurden für fünf Minuten bei 13000 rpm zentrifugiert. Der Transfer des Überstandes konnte dann in ein neues Reaktionsgefäß erfolgen. Im Anschluss wurden 400 μl eiskaltes Isopropanol zugegeben und alle Proben vorsichtig gemischt. Danach erfolgte eine Zentrifugation für fünf Minuten bei 13000 rpm und der Überstand wurde abgegossen. Dann wurde das Pellet bei Raumtemperatur getrocknet, in 100 μl TE-Puffer gelöst und bei 4°C gelagert.

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Zur Isolation größerer Mengen genomischer DNA von Tabakpflanzen wurde die CTAB-Methode genutzt (nach Doyle und Doyle, 1990) . Dazu wurde 1 g frisches Pflanzenmaterial geerntet und in flüssigem Stickstoff fein pulverisiert.

3 ml 60°C warmer CTAB-Puffer wurden unter einem Abzug zugegeben. Die Proben wurden danach gut gemischt und für 30 Minuten bei 60°C im Wasserbad inkubiert. Nach dem Abkühlen wurden 3 ml CI-Mix hinzugefügt und die Gefäße im Überkopfschüttler vier bis fünf Mal bewegt. Zur Phasentrennung fand ein Zentrifugationsschritt für 10 Minuten bei 6400 rpm bei Raumtemperatur statt. Die organische Phase wurde entfernt und die wässrige Phase wurde in ein neues Reaktiongefäß überführt und die Extraktionsschritte wurden wiederholt. Die DNA wurde danach mit 2 ml (2/3 Volumen) eiskaltem Isopropanol gefählt. Die Proben wurden invertiert und für 10 Minuten bei 4000 rpm sedimentiert. Das erhaltne Pellet wurde in 1 ml Waschpuffer gereinigt. Danach wurde der Waschpuffer entfernt. Anschließend wurde das Pellet mit 0,5 ml TE-Puffer, welcher mit 10 μg/ml RNase A versetzt, bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Im Anschluss fand ein Reinigungsschritt durch Zugabe von 1250 μl (2,5 Volumen) 96 % igem Ethanol und 250 μl (1/2 Volumen) Ammoniumacetat und danach wurden die Proben invertiert und bei 4600 rpm für 20 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde bei 37°C für 1 h getrocknet, in 200 μl TE-Puffer gelöst und bei 4°C gelagert.

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2.2.5 Vergleich transgener und nicht-transgener Pflanzen

Im Gewächshaus wurden sowohl die Entwicklung als auch der Phänotyp der transgenen Tabakpflanzen mit nicht-transgenen Tabakpflanzen oder KontrollPflanzen verglichen.

2.2.6 PCR

PCR oder die Polymerase-Kettenreaktion (englisch Polymerase Chain Reaction) (Mullis et al., 1986) ist eine Methode, um die DNA-Sequenzen der Zielgene in vitro zu vervielfältigen, wurden die entsprechenden Vor- und Rückwärts-Primer zugegeben (Tab. 4). Die Überprüfung des Vorliegens eines Gens in einer Pflanze erfolgt mit Hilfe einer PCR. Bei einer Mulitplex-PCR kann man mehrere Primerpaare für die Amplifikation des Zielgenes oder auch mehr als ein Gen auf einmal verwenden. Der PCR-Reaktionsansatz war wie in Tabelle 2 beschrieben zusammengesetzt.

Tab. 2: PCR-Reaktionsansatz mit zwei Primerpaaren.

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Für den PCR-Ansatz wurden unterschiedliche Mengen der DNA-Proben, abhängig von der DNA-Isolationsmethode, verwendet. Bei Proben der CTAB Methode und aufgrund ihrer hohen Reinheit wurde 1 μl DNA und bei Proben aus dem schnellen Methoden wurde 5 μl DNA für einen PCR-Ansatz verwendet. Das Gesamtvolumen eines PCR-Ansatzes betrug 25 μl. Wurden weniger oder mehr Primerpaare mit oder ohne DMSO im PCR-Ansatz verwendet, so wurde dementsprechend eine größere oder eine kleinere Menge H2O hinzugefügt.

Die Primerpaare haben generell unterschiedliche Annealingtemperaturen, deswegen ist es nötig für eine erfolgreiche Multiplex-PCR die entsprechende Annealingtemperatur zu wählen, so dass bei allen verwendeten Primerpaaren amplifiziert werden kann. Diese produzierten Amplifikate sollten zudem unterschiedliche Größen haben, damit sie leicht durch Agarosegel indentifiziert werden können. Eine Annealingtemperatur von 60°C wurde für alle Primerpaare verwendet. Die PCR-Standardbedingungen können der Tabelle 3 und die entsprechende Primerkombination Tabelle 4 entnommen werden.

Tab.3: PCR-Programm zum Nachweis von SOD, NMT und Tef1-Sequenzen. Die Tabelle zeigt die einzelnen PCR-Schritte mit der Dauer des Schrittes in s, der jeweiligen Temperatur in °C und der Anzahl der Wiederholungen.

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Tab. 4: Primerkombinationen für die jeweiligen Zielgene mit der Produktgröße in Multiplex- PCRs.

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In jeder PCR wurden neben Primern für die Zielgene SOD und NMT Primer für das Gen Tef1 eingesetzt. Tef1 ist ein nativ im Genom der Tabakpflanze vorkommender Elongationsfaktor. Die Qualität der isolierten DNA konnte über die Amplifikation des Tef1-Gens überprüft werden und dadurch, ob die isolierte DNA für eine PCR-Analyse verwendbar war. Bei jedem PCR-Versuch wurden Negativ- und Positivkontrollen und auch Wasserkontrollen verwendet. Als Negativkontrolle fungiert die DNA nichttransgener Tabakpflanzen, als Positivkontrolle Plasmide und als Wasserkontrolle die Verwendung von H2O anstelle von DNA.

2.2.7 Agarosegelelektrophorese

DNA wird in einer Agarosegelektrophorese nach ihrer Größe aufgetrennt. Agarosegele von 1 % oder 0,8 % wurden für die Analyse von PCR-Produkten eingesetzt. Eine Lösung mit 1 x TAE-Puffer sowie 1 % oder 0,8 % (w/v) wurde in einer Mikrowelle aufgekocht und unter kaltem Wasser auf ~45°C abgekühlt. Um die PCR-Produkten auf dem Gel zu visualisieren, wurde Red Safe Serva Stain G (0,002 μl/ml) der abgekühlten Lösung zugegeben. Danach wurde die Agaroselösung in einen Gelträger abgegossen und die Gelkämme eingesetzt.

Das Gel wurde nach 20 bis 30 Minuten fest und konnte dann mit 1 x TAE-Puffer in einem Elektrophoresegerät überführt werden. Die PCR-Proben konnten dann unter Verwendung von dem 100 bp DNA-Marker auf das Gel beladen werden. Bei 5V/cm erfolgte die Elektrophorese bis das Bromphenol-blau fast das Ende des Gels erreicht hatte. Die fluoreszierenden DNA-Banden konnten unter UV-Licht visualisiert und danach durch einer Kamera dokumentiert werden.

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2.2.8 RT-PCR

Nach der Integration des Zielgens in das Genom der Tabakpflanze wurde versucht festzustellen, ob die Zielgene transkribiert werden können. Deswegen wurde RNA aus transgenen Pflanzen unter Einsatz von RNATidy G Reagenz isoliert und für die cDNA-Synthese benutzt, um sie schließlich für eine normale PCR verwenden zu können.

2.2.8.1 RNA-Isolation

In dieser Arbeit wurden ca. 200 mg der jüngsten Tabakblätter entnommen und in Reaktionsgefäßen und flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Proben wurden mittels Aufschlusskügelchen zerkleinert und mit 1 ml RNA-Tidy G Reagenz pro Probe gereinigt. Das Pflanzenmaterial wurde dann im Precelly vier Mal 30 Sekunden lang bei 6.800 xg homogenisiert. Bei Raumtemperatur wurden die Proben für fünf Minuten inkubiert. 200 μl Chloroform wurden je Probe hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 2 min erneut inkubiert. Anschließend wurden die Proben für fünfzehn Minuten bei 13000 rpm und 4°C zentrifugiert. In ein 2 ml Reaktionsgefäß wurde der Überstand nach der Zentrifugation überführt. Nach der Zugabe von 500 μl eiskaltem Isopropanol wurden die Proben leicht gemischt und bei Raumtemperatur für zehn Minuten inkubiert. Der Überstand wurde nach 10 min Zentrifugation bei 4°C und 12000 rpm entfernt. Mit 650 μl 70 %-igem Ethanol wurde das Pellet gewaschen und bei 4°C und 7500 rpm für fünf Minuten zentrifugiert. Das RNA-Pellet wurde nach Entfernung des Überstands für 10 min bei Raumtemperatur getrocknet. Das Pellet wurde danach mit 30 μl DEPC-H2O (0,1 % DEPC v/v ) gelöst. Anschließend wurde die RNA-Reinheit und Konzentration mittels Photometer bestimmt. Für diesen Zweck wurde 1 μl RNA in 199 μl DEPC-H20 genommen und für das Photometer verwendet. Als Blank diente hier nur DEPC-H2O ohne RNA. Diese RNA wurde weiter für die cDNA-Synthese verwendet.

2.2.8.2 cDNA-Synthese

Für die Umschreibung der isolierten mRNA in cDNA wurde je 5 μg RNA in einem Gesamtvolumen von 12 μl DEPC-H2o ins Reaktionsgefäß hinzugefügt. Nach der Zugabe von 1 μl oligo (dT)18 Primer wurden die Proben bei 70°C für zehn Minuten inkubiert. Im Anschluss wurden 4 μl 5x Reaktionspuffer, 1 μl Ribonuclease Inhibitor (20 u/μl) und 2 μl dNTPs (10mM) hinzugefügt und bei 37°C für fünf Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurde 1 μl Reverse Transkriptase (RevertAidTM H Minus M- MuLu 200 u/μl) zugegeben und es erfolgte eine weitere Inkubation für 1 Stunde bei 42 °C. Die Inaktivierung der Enzyme wurde durch eine Erhitzung der Proben bei 70°C für 10 min erreicht. Die cDNA konnte dann bei -20°C für lange Zeit aufbewahrt werden. Diese cDNA für dann für die PCR gegen Tef1 und SOD-Gen verwendet.

2.2.9 Proteinisolation aus Tabakpflanzen

2.2.9.1 Mit Extraktionspuffer

Für die Proteinextraktion aus Pflanzengeweben wurde 200 mg frisches Blattmaterial geerntet und in flüssigem Stickstoff gemörsert. Danach wurde das Pflanzenpulver mit 500 μl Extraktionspuffer für 60 Minuten auf einem Schüttler bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden die Proben für 15 Minuten bei 4°C 13000 rpm zentrifugiert und 450 μl des Überstandes in ein neues Reaktionsgefäß überführt.

Extraktionspuffer :

- 500 mM Tris-Hcl,PH 7.5
- 10 mM EDTA
- 0.5 mM Nacl
- 1 mM PMSF

2.2.9.2 Proteinisolation mit PBS

Für die Enzymaktivitätsmessungen mittels DetectX® wurden die Protein nur mit PBS isoliert, um die Enzyminhibition durch PSMF im Extraktionspuffer zu vermeiden. 200 mg Blattmaterial wurden geernt und in flüssigem Stickstoff gemörsert. Die Proben wurden mit 500 μl PBS 1x für 30 Minuten auf einem Schüttler bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden die Proben für 15 Minuten bei Raumtemperatur und 13000 rpm zentrifugiert und 450 μl des Überstandes in ein neues Reaktionsgefäß überführt.

2.2.10 Western-Blot und Protein Detektion auf SDS-PAGE

Die Auftrennung von Proteinen nach ihrer relativen Molekülmasse erfolgte unter denaturierenden Bedingungen in 12,5 bis 16 %igen vertikalen SDS- Polyacrylamidgelen (Laemmli, 1970). Eine Proteinlösung der gewünschten Konzentration wurde mit 20 μl 5 X Sample Puffer versetzt, 10 Min in einem kochenden Wasserbad 94°C erhitzt und nach dem Abkühlen auf das Gel getragen.

2.2.10.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Es handelt sich hierbei um ein Proteine denaturierendes Verfahren. Die Proteine werden in diesem Prozess mit dem anionischen Detergens SDS (Natriumdodecylsulfat) behandelt, was zur Denaturierung zustande führt. Bei der Behandlung mit SDS gehen die Tertiär und Sekundärstrukturen der Proteine verloren. Hier wird das SDS sich an die Proteine lagern darüber hinaus deren Eigenladung verdecken. Danach ist das Protein gleichmäßig negativ geladen.

Zunächst wurde für die SDS-PAGE das Trenngel (Tab. 5) zusammengesetzt und in eine Gelkammer gegossen, die gewünschte Höhe des Trenngels (bis ca. 1,5 cm unter Kammer) markiert und dann mit Isopropanol überschichtet. Nach 25 bis 40 Minuten wurde das Isopropanol entfernt und mit Filterpapieren die Glasplatten von innen getrocknet. Dann wurde das Sammelgel (Tab. 5.1 vorbereitet und über das Trenngel gegossen.

Tab.5 : 12 % Trenngel

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tab.5.1 : 12 % Sammelgel

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Kämme wurden In das Sammelgel eingesetzt und nach ca. 10 Minuten wieder entfernt. Ein SDS-Laufpuffer wurde in den Gelbehälter gegossen bis dieser voll war.

5 x 20 μl Probenpuffer wurden mit 100 μl der Proteinproben bei 95°C für fünf Minuten aufgekocht und bei -20°C bis zur Verwendung gelagert. Mit 15 μl des Proteinmarkers und 20 μl der Proben wurden die Geltaschen beladen. Nach der Probenbeladung wird die Elektrophorese zunächst bei nicht-limitierender Stromstärke und bei einer Spannung von 50 V durchgeführt. Sobald die Front des Bromphenolblau-Farbstoffs vom Probenpuffer das Trenngel erreicht (nach ca. 50 Min), wird die Spannung auf 150 V erhöht. Die Elektrophorese wird erst beendet, wenn der Blaumarker das Gelende erreicht hat. Das Gel konnte danach für einen Western-Blot verwendet werden.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2.10.2 Western-Blot

Die Proteine, die in den SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt waren, wurden elektrophoretisch auf eine PVDF-Filtermembran übertragen. Erstens wurden drei Filterpapiere mit 1 x Laufpuffer ohne SDS getränkt und auf die Anode eines Semi- Dry-Electro-Blotters ohne Luftblasen zwischen den Schichten gelegt. Bevor die PVDF-Filtermembran auf die Filterpapiere platziert wurden, wurde die Membran zur Deaktivierung fünf Minuten in Methanol inkubiert. Die Gele mit den aufgetrennten Proteinen wurden aus ihren Gelkämmen genommen und das Sammelgel entfernt. Das Gel wurde auf die PVDF-Filtermembran aufgelegt und von der Kathode sowie vier mit 1 x Laufpuffer getränkten Filterpapieren bedeckt. Die Elektrophorese wurde auf 20 V mit einer Zeit von 0,8, sprich 45 Minuten, und einem Limit von 0,77 A (bei 10x14cm), eingestellt. Das Gel wird 30 min mit Coomassie gegengefärbt und anschließend 1,5 h oder über Nacht entfärbt. Die Membran wurde nach dem Transfer für fünf Minuten auf einem Schüttler in dH2o gewaschen. Vor dem Blocken der Membran wurden Molekulargewichtsmarker abgeschnitten und zwischen Papier getrocknet. Die Membran über Nacht auf einem Schüttler in eine 1:10 verdünnte Blockierungslösung inkubiert. Die Membran wurde fünf Minuten mit dH2o und fünf Minuten mit 1 x PBS auf einem Schüttler gewaschen. Danach wurde die (1:2000) mit 1 x PBS verdünnten Anti-His(C-term)- AP (Alkaline Phosphatase) Antikörpern für 1,5 Stunde zugefügt. Anschließend wurde die Membran drei Mal für fünf Minuten in 1 x PBS und fünf Minuten mit Substratpuffern gewaschen. Schließlich wurde die Membran für 5 bis 20 min zur Farbentwicklung in Substrat-Lösung ohne Schütteln inkubiert bis die Banden sichtbar waren, die Membran wurden mit Wasser gespült und zwischen Filterpapier getrocknet und im Dunkeln aufbewahrt.

2.2.11 Enzyme assay Superoxide Dismutase (SOD)

2.2.11.1 Assay-Prnzip

Ein Rindererythrozyten-SOD-Standard ist bereitgestellt, um eine Standardkurve für den Test zu generieren und alle Proben sollten aus der Standardkurve abgelesen werden. Die Proben wurden in einer speziell gefärbten Probe verdünnt und in die Vertiefungen pipetiert. Das Substrat wurde zugegeben, von Xanthin-Oxidase- Reagenz gefolgt und bei Raumtemperatur für 20 Minuten inkubiert. Die Xanthinoxidase erzeugt Superoxid in Gegenwart von Sauerstoff, welcher ein farbloses Substrat in dem Nachweisreagenz in ein gelb gefärbtes Produkt umwandelt. Dieses gefärbte Produkt wird bei 450 nm abgelesen. Zunehmende SOD- Werte verursachen in den Proben eine Abnahme der Superoxid-Konzentration und eine Verringerung des gelben Produkts. Die Aktivität der SOD in der Probe wird unter Verwendung einer Software berechnet, welche mit den meisten Plattenlesern kompatibel ist. Je nach Verdünnung können die Ergebnisse dabei entsprechend korrigiert werden. Die Ergebnisse werden in Einheiten von SOD-Aktivität pro ml ausgedrückt.

2.2.11.2 Standard- und Proben-Vorbereitung

Für die Vorbereitung des Superoxiddismutase-Standards sollte sechs Röhren von 2-7 nummeriert werden. Als Standard 1 wurde den von dem Kit bereitgestellt Standar verwendet, von den wurden dann die anderen hergestellt. Erstens sollte 250 μl Assay-Puffer zum Standard1 hinzugefügt, gemischt und bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkkubiert.In allen anderen Reaktionsgefäßen wurde dann 75 μl Assay- Puffer zugegeben. Von dem Standard1 wurde 75 μl in Reaktionsgefäßen 2 bis 7 pipetiert und gut gemischt. Diesen Schriet sollte für Reaktionsgefäßen 2 bis 7 wiederholt werden. Die 10μl Proteine werden mit 10 μl Assay-Puffer, 50 μl Substrat und 25 μl Xanthine Oxidase gemischt und für 20 Min bei Raumtemperature inkubiert und bei 450 nm gelesen. Die Erwartete SOD-Aktivität von diesen Standards wurde als U / ml in Tabelle 6 gezeigt. Die Proteine werden mit Assay-Puffer, Substrat und Xanthine Oxidase gemischt und bei 450 nm gelesen

Tab.6 : Standard (Stn) 1 bis 7 mit Volumen der Zugabe von jedem Röhrchen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3. Ergebnisse

3.1 „Leaf-paint“-Test der Tabakpflanzen

Selektive Marker in Züchtungsprozessen können auch neben der molekularen Analysierung mittels PCR verwendet werden, um nicht-transgene von transgenen Tabakpflanzen zu unterscheiden. Als selektives Markergen wurde in dieser Arbeit das bar-Gen untersucht. Ein Leaf Paint Assay wurde mit allen Tabakpflanzen durchgeführt, um die Qualität der Transformation durch Expression des bar-Gens zu überprüfen. Hier wird nicht das Transgen im Genom der Pflanze nachgewiesen, sondern eine Eigenschaft, die mit den anderen Genen auf dem Transformationsvektor zur Kontrolle lag.

Die ganzen Tabakpflanzen wurden für diesen Test mit einer (600 mg/l) BASTA®- Lösung behandelt und markiert. Nach einer Woche wurde der Test ausgewertet und in die zwei Kategorien (+) und (-) eingestuft. Der Test wurde als positiv (+) betrachtet, wenn das Herbizid BASTA® keine sichtbare Veränderungen auf der Blattfläche zeigte (Abb.11 A). Bei einem negativen Ergebnis (-) war die Blattfläche stark chlorotisch oder ganz abgestorben (Abb.11 B). Die Kontrolle dient um festzustellen, ob das Absterben des Blattes nach Behandlung mit BASTA® auf das Herbizid und nicht auf andere Faktoren zurückzuführen ist (Abb.11 C). Theoretisch enthalten alle positiven Tabakpflanzen das bar-Gen und das bedeutet, bei Aufnahme des Plasmids und Einbau ins Erbgut werden die Gene für die Glufosinat-Resistenz mitgebracht. Alle diese positiv getesten Tabakpflanzen wurden als Kandidaten für die weitere molekulare Charakterisierung betrachtet.

In Anhang 1, 2, 3 und 4 sind die Leaf Paint-Gesamtergebnisse zusammengefasst. Die Blätter aller transformierten Tabakpflanzen zeigten nach der Herbizidbehandlung keine Veränderung. Die Ergebnisse der nicht-transgenen Tabakpflanzen waren dagegen stark chlorotisch.

Abb. 11: Ergebnis des Leaf Paint-Tests eine Woche nach Behandlung mit 600 mg/l BASTA®. Deutlich zu sehen ist (A und E) ein positives Ergebnis einer Tabakpflanze ohne sichtbare Veränderungen, (B und F) abgestorbene Tabakpflanze stellt ein negatives Ergebnis dar, (C) eine Blatthälfte wurde mit Herbizid behandelt und die andere Hälfte nicht und diese dient als Kontrolle. (D) Behandlung die Tabakpflanzen mit BASTA®.

3.2 Phänotypischer Vergleich zwischen nicht-transgenen und transgenen Tabakpflanzen

Im Gewächshaus wurden sowohl nicht-transgene Tabakpflanzen als auch transgene Tabakpflanzen der ersten Generation kultiviert. Die Pflanzen wurden neben der Analyse mit molekularen Methoden auch optisch begutachtet. Generell wurde im Gewächshaus kein phänotypischer Unterschied zwischen Kontrollen oder nicht transgenen und transgenen Tabakpflanzen beobachtet (Abb. 12). Die

Entwicklungsdauer war auch gleich bei den transgenen und nicht-transgene Pflanzen. Nach Aussaat der Tabaksamen dauerte es etwa zwei Wochen bis zur Germination und etwa 4 Monaten zur Ausbildung der Blüten, aber die Samen wurden erst nach 5 Monaten geernet. Abhängig von den Inneren und äußeren Bedingungen wie der Temperatur verlängerte oder verringerte sich die Vegetationszeit der Tabakpflanzen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 12: Optischer Vergleich zwischen Kontrollen oder nicht-transgenen (K) und transgenen Tabak (T) Tabakpflanzen nach drei Wochen (A) und nach 6 Wochen (B).

3.3 Molekulare Charakterisierung mittels PCR

Für die Entwicklung eines Impfstoff gegen D.Viviparus wurde zunächst die transgene Tabakpflanze mit SOD (Superoxiddismutase) und NMT (N-Methyltransferase) hergestellt. Die Charakterisierung nachfolgender Generationen und die Überprüfung der Integration von SOD und NMT in Tabakpflanze erfolgten über Multiplex - und Standard-PCRs. Einige Beispiele von Multiplex-PCRs wurde in Abbildung 13; 13.1 und 13.2 dargestellt, in denen Primer einerseites für die Gene SOD und Tef1, andererseites für NMT und Tef1 zusammen kombiniert wurden (Abb.14; 14.1). Die Integration der SOD und NMT Gene in das Tabakgenom wurde durch die Amplifikation mittles PCR von den entsprechenden Fragmenten sichtbar. Als Kontrolle der DNA-Qualität diente die Untersuchung des Tef1-Gens. Das Tef1-Gen kodiert für ein Tobacco Elogation factor und ist in allen Tabakpflanzen enthalten. Als negative Kontrolle wurde die DNA einer nicht-transgenen Tabakpflanze eingesetzt. Wie in Abbildung 13 zu sehen ist, sollte diese nur eine Bande des Tef1-Gens zeigen. Falls in einer PCR keine Tef1-Bande sichtbar war, so musste zunächst die DNA- Isolation und PCR wiederholt werden.

3.3.1 Charakterisierung der SOD-Gene

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 13: Agarosegel nach der Amplifikation des SOD (600 bp) und Tef1 (840 bp)Genes mittels PCR in T1 generation. M: GeneRulerTM 100bp DNA Ladder Plus(s.Anhang),W: SOD Reaktionsansatz ohne DNA als Wasserkontrolle. Bahn 2: SOD 22/K 9,1. Bahn 3: SOD 9/K 5,4. Bahn 4: SOD 9/K 5,3. Bahn 5: SOD 9/K 5,2. Bahn 6: SOD 22/K 9,2. Bahn 8: SOD 13/K 6,4. -C: DNA aus einer nicht transgenen Tabakpflanze als Negativkontolle. +C:SOD plasmid als positivekontrolle .

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 13.1: Agarosegel nach der Amplifikation des SOD (600 bp) und Tef1 (840 bp)Genes mittels PCR in T1 generation. M: Gene Ruler TM 100bp DNA Ladder Plus(s.Anhang),Bahn 1: SOD 13/K 6,4. Bahn 2: SOD 13/K 6,2. Bahn 3: SOD 9/K 5,4. Bahn 4: SOD 22/K 9,1. Bahn 4: SOD 9/K 5,4. Bahn 5: SOD 13/K 6,1. +C :SOD plasmid als positivekontrolle. -C : DNA aus einer nicht transgenen Tabakpflanze als Negativkontolle . W: SOD Reaktionsansatz ohne DNA als Wasserkontrolle.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 13.2: Agarosegel nach der Amplifikation des SOD-Genes mittels PCR (600 bp) und Tef1 (840 bp) in T1 generation: M: GeneRuler TM 100bp DNA Ladder Plus(s.Anhang),Bahn 1: SOD 13/K 6,3. Bahn 2: SOD 34/K 12,4. Bahn 3: SOD 22/K 9,4. Bahn 4: SOD 13/K 6,2. Bahn 5: SOD 9/K 5,2. Bahn 6: SOD 9/K 5,5. Bahn 7: SOD 34/K12,2. Bahn 8: SOD 21/K 8,1. Bahn 9: SOD 22/K 9,5. Bahn 10: SOD 34/K12,3. Bahn 11: SOD 9/K 5,1. Bahn 12: SOD 22/K 9,3. Bahn13: SOD 34/K 12,1, +C: SOD plasmid als positivekontrolle. W: SOD Reaktionsansatz ohne DNA als Wasserkontrolle. -C: DNA aus einer nicht transgenen Tabakpflanze als Negativkontolle.

3.3.2 Charakterisierung der NMT-Gene

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 14: Agarosegel nach der Amplifikation des NMT (575 bp) und Tef1 (840 bp)-Gens mittels PCR in T1 generation. M: GeneRuler TM 100bp DNA Ladder Plus(s.Anhang), Gel B:Bahn 1: NMT 34/K 5,3. Bahn 2: NMT 1/K 2,4. Bahn 3: NMT 34/K 5,1. Bahn4: NMT 15/K 7,2. Bahn 5: NMT 45/K 18,1. Bahn 6: NMT 16/K 9,2,Bahn 7: NMT 65/K 24,5. Bahn 8: NMT 65/K 24,4. Bahn 9: NMT 34/K 5,2. Bahn 10: NMT 65/K 24,2. Bahn 11: NMT 1/K 2,3. Bahn 12: NMT 33/K 17,1. Bahn 13: NMT 16/K 9,3. +C: NMT plasmid als positivekontrolle. W: NMT Reaktionsansatz ohne DNA als Wasserkontrolle. -C: DNA aus einer nicht transgenen Tabakpflanze als Negativkontolle.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 14.1: Agarosegel nach der Amplifikation des NMT(575 bp) und Tef1 (840 bp)-Gens mittels PCR in T1 generation. M: Gene Ruler TM 100bp DNA Ladder Plus(s.Anhang). Bahn 1: NMT 1/K 2,5. W: NMT Reaktionsansatz ohne DNA als Wasserkontrolle. Bahn 3: NMT 1/K 2,2. Bahn 4: NMT 1/K 2,1. Bahn 5: NMT 16/K 9,1. Bahn 6: NMT 33/K 17,5. Bahn 7: NMT 33/K 17,2. Bahn 8: NMT 15/K 9,4. +C: NMT plasmid als positivekontrolle. -C : DNA aus einer nicht transgenen Tabakpflanze als Negativkontolle.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 15: Agarosegel nach der Amplifikation des SOD(600 bp) und Tef1 (840 bp)-Genes der zweiten Generation mittels PCR in T2 generation. M: GeneRuler TM 100bp DNA Ladder Plus(s.Anhang). Bahn2:SOD22/k9,4. Bahn3:SOD13/k6,1. Bahn4: SOD13/k6,4. Bahn5: SOD32/k12,4. Bahn6:SOD9/k5,3. Bahn7:SOD34/K12,1. Bahn 8:SOD 22/k9,1. Bahn 9:SOD 34/k12,2. -C: DNA aus einer nicht transgenen Tabakpflanze als Negativkontolle. +C: SOD plasmid als positivekontrolle. W: SOD Reaktionsansatz ohne DNA als Wasserkontrolle.

3.3.4 Charakterisierung der NMT-Gene der zweiten Generation

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 16: Agarosegel nach der Amplifikation des NMT(575 bp) und Tef1 (840 bp)-Genes der zweiten Generation mittels PCR in T2 generation. M: Gene Ruler TM 100bp DNA Ladder Plus(s.Anhang). Bahn 1: NMT 1/K 2,1. Bahn 2:NMT/K2,3. Bahn 3: NMT 45/K 18,1. Bahn 4: NMT 45/K 18,2. Bahn 5: NMT 16/K 9,3. Bahn 6: NMT 16/K 9,4. Bahn 7: NMT15/K 7,1. Bahn 8: NMT65/K 24,2. -C: NMT Reaktionsansatz ohne DNA als Wasserkontrolle. +C: NMT plasmid als positivekontrolle. W : DNA aus einer nicht transgenen Tabakpflanze als Negativkontolle

3.4 RT-PCR

Nach der Überprüfung der Zielgene auf DNA-Ebene wurde hier auf RNA-Ebene die Expression des Zielgenes untersucht. Deswegen wurden drei RNA-Proben von den transgenen Tabakpflanzen und zwei von den Kontrollen isoliert. Mittels RT-PCR wurde dann diese RNA in cDNA umgeschrieben, um festzustellen, ob das Zielgen in der Tabakpflanze transkribiert werden kann. Die PCR-Reaktion wurde gegen die Zielgene, SOD-Gen und Tef1-Gen, nach der Synthese der cDNA durchgeführt und die Ergebnisse sind in Abbildung 17 abgebildet. Die SOD-Gene haben keine Introns. Deswegen wurden die Gene mit der gleichen Größe genauso wie im Fall der gDNA erwartet. Bei cDNA-Proben, welche für RT-PCR verwendet werden, ist es immer wichtig sicherzustellen, dass es sich nicht um Kontamination mit genomischer DNA handelt. Deswegen wurde hier das Tef1-Gen verwendet, welches ein Intron von 100bp besetzt und zusätzlich wurde in den ersten zwei Spuren RNA-Proben statt cDNA verwendet. Das Tef1-Amplifikationsprodukt der cDNA weist eine Größe von 740 bp auf, während die genomische DNA eine Größe von 840 hat. Deswegen müsste die Bande der genomischen DNA ca. 100bp größer als die Bande der cDNA sein, wenn die RNA keine Kontamination mit DNA aufwies.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 17: RT-PCRs von T2-Pflanzen . Agarosegel nach des SOD- und Tef1-Gens aus cDNA mit gDNA als kontrolle. Primer für die Gene Tef1 (gDNA: 840 bp; cDNA: 740 bp) cDNA und gDNA für SOD-Gen hat die gleichen bp (s.Tab 4.A). M:GeneRulerTM 100bp DNA Lader plus, Spuren 1 und 2 sind RNA von Pflanzen SOD22/k9,4 und SOD13/k6,1. Spuren 3 bis 5 sind cDNA aus Pflanzen SOD22/k9,4; SOD13/k6,1 und SOD 34/k12,4. Spur 6: Positivkontrolle für SOD-Gen. Spur 7: -CK: cDNA einer nicht-transgenen Tabakpflanze als Kontrolle. Spuren 8 und 9 : -gK: gDNA einer nicht-transgenen Tabak als Kontrolle. Spur 10: Wasserkontrolle.

In den Spuren 1 - 2 befindet sich die PCR-Amplifikation der RNA, welche die Reinheit der RNA bedient. Das PCR-Produkt der cDNA von den SOD- transgenen Tabakpflanzen wurden in Spuren 3-5 aufgeladen. In Spur 6 wurde die SODPositivkontrolle aufgetragen. Als Negativekontrolle dient die cDNA einer nicht transgenen Tabakpflanzen, welche nur das Tef1-Gen in einer Größe von 740 bp aufweisen kann, weilTef1 ein Intron in einer Größe von 100 bp besitz und wurde in Spur 7 aufgetragen. Dagegen befindet sich die PCR-Amplifikation der gDNA einer nicht transgenen Pflanze in Spuren 8 welche eine Größe von 840 bp hat. Die Wasserkontrolle in Spur 10 zeigt keine Bande. Alles zusammen beweist, dass das Zielgen SOD in Tabak transkribiert werden kann.

3.5 Western-Blot/Immunfärbung

In Rahmen dieser Arbeit erfolgte eine Untersuchung auf Protein-Ebene für die SOD- und NMT-Gene. Proteine wurden hier von transgenen Tabakpflanzen, die mittels PCR ihre integrierten Gen nachgewiesen haben, isoliert und für Western-Blot verwendet. Als Kontrolle wurden Proteine von nicht- transgenen Tabakpflanzen verwendet. Mittels Western-Blot wurden die SOD- und NMT-Proteine analysiert und schließlisch ein Immunostaining durchgeführt. Mit einem Anti-His(C-term)- AP (Alkaline Phosphatase) Antikörper wurde der Western-Blot hybridisiert. Generell konnte für die Tabakpflanzen, die das SOD-Transgen aufwiesen, ein Band mit einer Größe von ~19 kDa gezeigt werden (Abb. 18 und 18.1) und genauso bei der zweiten Generationen von Pflanzen im Fall des SOD-Gens (Abb. 20 A). Für diejeniegen, die das NMT-Transgen aufwiesen, konnte ein Band zwischen 35 kDa und 40 kDa gezeigt werden (Abb.19 A). Kein Signal wurde bei den Proteinproben von Kontrollen, die nicht über das SOD- bzw. NMT-Gen verfügen, erkannt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 18: Western-Blot/Immunfärbung. Western-Blot hybridisiert mit einem mit Anti- His(C-term)/AP Ab Antikörper für SOD-Proteine. 8 verschiedene Proteinproben auf PVDF- Membran . M: PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder (s.Anhang). Bahn1: SOD 34/K 12,1. Bahn 2: K1 Protein aus einer nicht transgenen Tabakpflanze als Negativkontrolle. Bahn3: SOD Positivekontrolle. Bahn4: k2 Protein aus einer nicht transgenen Tabakpflanze als Negativkontrolle. Bahn5: SOD 9/K 5,1. Bahn 6: SOD 9/K 5,3. Bahn 7: SOD 9/K 5,2. Bahn 8: SOD 22/K 9,1.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.18.1: Western-Blot/Immunfärbung. Western-Blot hybridisiert mit einem mit AntiHis(C-term)/AP Ab Antikörper für SOD-Proteine. 8 verschiedene Proteinproben auf PVDFMembran. M: PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder (s.Anhang). Bahn1 : SOD 22/K 9,4. Bahn 2: K1 Protein aus einer nicht transgenen Tabakpflanze als Negativkontrolle Bahn3: SOD 22/K 9,3. Bahn 4: K2 Protein aus einer nicht transgenen Tabakpflanze als Negativkontrolle.Bahn5: SOD 13/K 6,2. Bahn 6: K3 Protein aus einer nicht transgenen Tabakpflanze als Negativkontrolle. Bahn 7: SOD Positivekontrolle. Bahn8: K4 Protein aus einer nicht transgenen Tabakpflanze als Negativkontrolle.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 19: A) Western-Blot/Immunfärbung. Western-Blot hybridisiert mit einem mit Anti- His(C-term)/AP Ab Antikörper für NMT-Proteine. 10 verschiedene Proteinproben auf PVDF-Membran. M: Spectra™ Multicolor Broad Range Protein Ladder (s.Anhang). Bahn1: NMT 45/K 18,1. Bahn 2: NMT 16/K 9,3. Bahn 3: NMT 16/K 9,4. Bahn 4: NMT 16/K 9,2. Bahn 5: NMT 16/K 9,1. Bahn 6: NMT 15/K 7,1. Bahn 7: NMT 34/K 5,2. Bahn 8: NMT 34/K 5,3. Bahn 9: NMT 45/K18,3. Bahn 10: Protein aus einer nicht transgenen Tabakpflanze als Negativkontrolle. B) Immunfärbung der NMT-Proteine: Die gleiche Proteinproben mit dem gleichen Reihenfolge auf 12% SDS-PAGE Gel mit Coomassie gegengefärbt.

3.5.1 Western-Blot der Zweiten Generation: SOD

Abb.20 : A) Western-Blot/Immunfährbung. Western-Blot hybridisiert mit einem mit Anti-His(C-term)/AP Ab Antikörper für zweiten Generation der SOD-Proteine. 9 verschieden Proteinproben auf PVDF-Membran. M: PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder (s.Anhang).Bahn1: SOD 9/K 5,1.Bahn 2: K1 Protein aus einer nicht transgenen Tabakpflanze als Negativkontrolle. Bahn 3: SOD 9/K 5,2. Bahn 4: K2 Protein aus einer nicht transgenen Tabakpflanze als Negativkontrolle. Bahn 5: SOD 34/K 12,4. Bahn 6: K3 Protein aus einer nicht transgenen Tabakpflanze als Negativkontrolle. Bahn 7: SOD Positivekontrolle. Bahn 8: K4 Protein aus einer nicht transgenen Tabakpflanze als Negativkontrolle. Bahn 9:SOD 22/k9,3. B) Immunfärbung der zweiten Generation der SOD-Proteine: Die gleiche Proteinproben mit dem gleichen Reihenfolge auf 12% SDS-PAGE Gel mit Coomassie gegengefärbt.

3.6 Enzym-Assay der Superoxiddismutase (SOD)

Für das SOD-Gen erfolgte eine Untersuchung auf Enzym-Ebene. Für diesen Test wurden die Proteine von nicht-transgener und transgener Tabakpflanze nur mit PBS isoliert (s.2.2.9.9), um die Inhibierung der Enzymaktivität zu vermeiden, die durch andere Proteinextraktionspuffer verursacht werden könnte.

Die Proteine werden mit Assay-Puffer, Substrat und Xanthine Oxidase gemischt und bei 450 nm gelesen. Proteinproben von Tabakpflanzen, die das SOD-Gen enthielten, zeigten unterschiedliche Enzymaktivität (Abb. 21 und 22). Proteinproben von nicht- transgenen Pflanzen zeigten dagegen keine Aktivität. Nach der Behandlung der Proteinproben mit KCN als spezifischem Inhibitor und NaNH3 als unspezifischem Inhibitor wurde keine SOD-Aktivität gemessen (Abb. 21 und 22). Nach der Messung der Proteinproben bei 450 nm wurde der Mittelwert von allen Proben berechnet und in Abb.21.1 und 22.1 zusammengefasst. Schließlich wurden diese Mittelwerte als Diagramm dargestellt und mit dem Standard und Proben, die mit KCN und NaNH3 behandelt wurden, verglichen (Abb.21.2 und 22.2). Die Proben , die mit KCN oder NaNH3 behandelt wurden, sollen eine niedrige Enzym-Aktivität im vergleich zu den unbehandelten Proben zeigen und diese wurde laut Abb 21 und Abb 22 bestätigt, da die Werte der mit KCN oder NaNH3 behandelten Proben im bereich 0,5 U/ml und mehr liegen, während die Werte der unbehandelten Proben weniger als 0,5 U/ml zeigten.

Abb. 21: Zusammenfassung des Enzym-Assays der SOD nach der Messung bei 450 nm

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Farblegende der Proteinproben und ihre Behndlungen

Standard (SOD-Akitivität Kit)

Proteinproben von Transgenen Tabakpflanzen: (3,4)A=SOD 34/K 12,1. (3,4)B= SOD 9/K 5,1. (3,4)C= SOD 9/K 5,3. (3,4)D= SOD 9/K 5,2. (3,4)E=SOD 22/K 9,1. (3,4)F= SOD 22/K 9,4. (5,6)A= SOD 22/K 9,3. (5,6)B=SOD 13/K 6,2. (5,6)C= SOD 9/K 5,1. (5,6)D=SOD 9/K 5,2. (5,6)E=SOD 34/K 12,4. (5,6)F=SOD 22/k9,3. (5,6)G= SOD 4, K4,1. (5,6)H= SOD 4, K4,3. (7,8)A= SOD 4, K4,4. (7,8)B= SOD 5, K4,3.

ProteinProbe von nicht-Transgenen Tabakpflnzen (Kontrolle).

Die gleichen Proteinproben in (5,6)A-H wurdem mit Kaliumcyanidlösung (KCN) für die spezifische Hemmung der Cu / Zn und extrazelluläre SOD behandelt.

Die gleichen Proteinproben in (5,6)A-H wurdem mit (NaNH3) für eine unspezfische Hemmung der alle Arten von SOD behandelt.

( Weiß) Leer

Abb. 21.1: Zusammenfassung der Mittelwerte von allen Proteinproben .

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 21.2 : Superoxiddismutase-Aktivität (U/mL)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 22: Zusammenfassung des Enzym-Assays nach der Messung bei 450 nm.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Farblegende: Siehe Abb.21

(3,4)A=SOD 4, K4,1. (3,4)B=SOD 4, K4,3. (3,4)C= SOD 4, K4,4. (3,4)D= SOD 9, K5,1.

(3,4)E= SOD 9, K5,2. (3,4)F=SOD 9, K5,3. (3,4)G= SOD 9, K5,5. (3,4)H=

SOD5/K4,1.(5,6)A= SOD5/K4,2. (5,6)B= SOD5/K4,3. (5,6)C= SOD5/K4,5.

(5,6)D=SOD26/k9,1. (5,6)E= SOD26/k9,3. (5,6)F= SOD26/k9,5. (5,6)G= SOD18/k8,1.

(5,6)H= SOD18/k8,2. (7,8)A=SOD18/k8,5. (7,8)B= SOD8/k5,1: (7,8)C=SOD0/K4,5.

(7,8)D=SOD0/K4,3. (7,8)E=SOD0/K4,2. (7,8)F=SOD13/K6,1.

Abb. 22.1: Zusammenfassung der Mittelwerte von allen Proteinproben .

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 22.2 : Superoxide Dismutase Aktivität (U/mL)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

4 Diskussion

4.1 Bar-Gen als Selektionsmarker („Leaf-paint “Test)

Neben den zwei Zielgenen (SOD, PNMT) wurde auch das bar-Gen in allen Generationen und Stammlinien untersucht. Das Prinzip des bar-Gens als Selektionmarker ist, wie von Ramessar und Peremarti et al. 2007 beschrieben wurde, die Fähigkeit, transgene Nachkommenschaften zu selektieren. Die Transformation der Tabakpflanzen mit Genen für SOD und NMT hat vor Beginn dieser Arbeit an der Tierärztlichen Hochschule Hannover stattgefunden (IPB, Hassan). Die zur Transformation der Tabakpflanzen angewendeten Vektoren enthielten nicht nur die Zielgene, sonderen auch das Bar-Gen als Selektionmarker. Der aktive Bestandteil von BASTA® wurde durch PAT Enzyme detoxifiziert, welche vo Bar-Gen kodiert wurden (Zang et al. 2009). Deswegen wurde in dieser Arbeit der Leaf Paint-Test angewendet, um den Resistenz-Grad nicht-transgener und transgener Tabakpflanzen gegenüber BASTA® zu überprüfen. Die Leaf Paint-Ergebnisse zeigten, dass ein Großteil der transgenen Tabakpflanzen positiv war und dadurch Toleranz gegenüber dem BASTA® aufwies. Als erster Schritt zur Selektion war Leaf Paint in dieser Arbeit gut geeignet. Transgene Tabakpflanzen mit SOD-Gen waren im Leaf Paint-Test um einiges positiver als transgene Tabakpflanzen mit NMT-Gen. Generell waren ca. 90 % der potenziele SOD transgenen Tabakpflanzen bar-Gen positiv und ca. 85 % der potenziel NMT transgenen Tabakpflanzen. Dies beweist wie gut die Transformation war, aber es ist kein deutlicher Hinweis, dass die Zielgene ins Genom der Tabakpflanze intergriert sind, da das bar-Gen in der Nähe der LB gesperrt ist.

Es gibt viele Faktoren, die die Expression von Transgenen deutlich und stark beeinflussen wie z.B. die Kopienzahl, externe Umwelteinflüsse, die epigenetischen Effekte oder der Integrationsort (Vaucheret et al. 1998; Meng et al. 2006). In eingen Pflanzen wie Medicago sativa kann ein Silencing des pat-Transgens durch Umweltfaktoren, z.B. hohe Temperaturen, verursacht werden (Walters et al., 1999). Das Gene Silencing des Bar- Gens könnte der Grund sein, dass einige transgene Pflanzen Intoleranz gegnüber dem BASTA® aufweisen. Gene Silencing ist ein Prozess, welcher durch epigenetische Veränderungen der DNA verursacht wird, wie insbesondere Histonmodifikationen, DNA-Methylierung oder Triggerung vom RNA Umsatz (Matzke und Matzke, 1998) und starke Überexpression von Promotor (d35S Promotor).Generell erfolgt die Genregulation beim Gen-Silencing entweder durch eine Hemmung der Transkription, d.h. die DNA-Informationen wurden nicht auf mRNA getragen (transkriptionelles Gen-Silencing) oder die Hemmung der Translation durch Verhinderung der Übersetzung der genetischen Informationen auf der mRNA in ein Protein. Dies wird als post-transkriptionelles Gen-Silencing bezeichnet (Filipowicz, W., L. Jaskiewicz, et al., 2005).

Die Transgene in transgenen Pflanzen sind durch einen epigenetischen Effekt für eine Stilllegung anfällig (Crews, Gore, et al. 2007). Bei den Transgenen kann das Gene Silencing in trans- oder cis Position erfolgen und es wirkt unterschiedlich in beiden Positionen. Bei trans-Inaktivierung beeinflusst ein Genlocus einen anderen, aber im Fall einer cis-Inaktivierung wurden die Prozesse den Locus bewirkt (Vaucheret et al. 1998). Auf der transkriptionellen Ebene werden, wie von Matzke et al. 2002 beschrieben wurde, die Gene ausgeschaltet, wenn im Promotorbereich verschiedene Gene homolog sind. Wenn in der transkribierenden Region Homologien durch die Gene gezeigt wurden, erfolgtein Gene Silencing in post-transkriptionale Ebene (Cogoni, C. and G. Macino .1999).

4.2 Analyse der PCR-Ergebnisse

Nach Durchführung eines LP-Tests auf BASTA®-Toleranz und somit auf die erfolgreiche Transformation der Zielgene (SOD, NMT) in die Tabakpflanzen, wurde die DNA aus den LP-positiven Tabakpflanzen isoliert und mittels PCR auf die Existenz des SOD-Gens, NMT-Gens sowie des Tabak-Gens Tef1 getestet. Um die Qualität der DNA-Isolation zu beurteilen, wurde eine PCR gegen den Tabak- Elongationfactor (Tef1, NCBI, AF120093) als Kontrolle durchgeführt. Wie die Anhänge 1,2,3 und 4 zeigen, war eine erfolgreiche DNA-Isolation aus allen Tabalpflanzen in dieser Arbeit möglich. Im Fall des SOD- und des NMT-Gens der potenziele transgen tabakpflanzen zeigten die PCR-Ergebnisse, dass ca. 64 % der gesamten Versuchpflanzen das SOD-Gen und ca. 58 % das NMT-Gen enthalten (Anhang.1 und 2). Bei einigen Klonen wie z.B. (SOD34/k12,3; SOD4/k4,5; SOD5/k4,4;) konnte das SOD-Gen und bei Klonen (NMT65/K24,4; NMT52/K22,3) das NMT-Gen nicht nachgewiesen werden. Deswegen konnte nur das Vorhandensein des Tef1-Gens weiter getestet werden. Da die beiden Gene SOD und Bar auf dem gleichen Vektor sind, gilt theoretisch das Vorhandensein des Bar-Gens im Genom der Tabakpflanze als Hinweis auf das Vorhandensein des SOD-Gens, weil die Leserichtung von Right Border (RB) zu Left Border (LB) ist und das Bar-Gen sehr nahe dem LB liegt, hingegen sich das Zielgen SOD nicht weit vor der RB befindet (Abb. 8.1 :SOD Funktion Karte). Bei folgenden Klonen (SOD34/k12,3; SOD4/k4,5; SOD5/k4,4; NMT65/K24,4; NMT52/K22,3) konnten die beiden Gene sowohl SOD- Gen, als auch NMT-Gen nicht mittels PCR nachgewiesen werden, obwohl diese Klone BASTA®-Toleranz zeigten und somit Hinweis auf das Vorhandensein des Bar- Gens. Es ist sehr wahrscheinlich, dass es sich bei diesen Klonen um falsch-Positive handelt und das bedeutet, dass hier nur das Bar-Gen ohne das Zielgen übertragen werden konnte. Bei allen PCR wurde immer abhängig von dem Zielgen (SOD, NMT) eine Positive Kontrolle hinzugefügt, um festzustellen, ob es sich um die richtigen Zielgene handelt oder eine falsch-Positive und dadurch konnte festgestellt werden, dass die Gene ins Genom der Versuchpflanze intergriert wurden (s.Abb. 13; 13.1;

13.2 und 14; 14.1). Einige Klone ( NMT33/k17,2; SOD13/k6,3) konnten überhaubt nicht als transgen identifieziert werden, da sie schon im Gewächshaus keine BASTA®-Toleranz gezeigt hatten. Alle Klone, bei denen der LP-Test positiv war und das Zielgen mittels PCR nachgewiesen werden konnte, bieten einen deutlichen Hinweis dafür, dass das gesamte DNA-Stück zwischen RB und LB (T-DNA) ins Genom der Versuchpflanze übertragen wurde. Diese Pflanzen gelten als Kern für weitere Experimente, da ihre Samen schon geerntet und bewahrt wurden. Die Generationen, die aus diesen Samen stammen, werden mit Methoden, die schon in der ersten Generation angesetzt wurden, gehandelt und weiter selektiert.

4.3 Analyse der RT-PCR

Nach der Intergration des Zielgens in das Genom der untersuchten Pflanze ist es sehr wichtig, ihre Expression auf RNA-Ebene zu überprüfen. Deswegen wurde in dieser Arbeit RNA von transgene Tabakpflanzen isoliert und ihre Reinheit photometrisch bestimmt. cDNA wurde von dieser RNA synthesiert und weiter für PCR verwendet. PCR gegen Tef1, welches ein Intron in einer Größe von 100 bp besitzt, wurde durchgeführt. Das Intron dient als Kontrolle, da das PCR-Produkt der gDNA aus einer nicht transgener-Tabakpflanze 100 bp größer als das PCR-Produkt der cDNA sein sollte und das ist deutlich zu merken (Abb. 17). Das weist darauf hin, dass es sich um cDNA handelt und keine Kontamintaion mit gDNA vorhanden ist. Nachdem es als sicher gilt, dass keine Kontamination mit gDNA vorhanden ist, wurde weiter PCR gegen das SOD-Gen durchgeführt. Alle transgenen-Tabakpflanzen konnten hier das Vorhandensein der Transkription des SOD-Genes nachweisen und bestätigen (Abb. 17).

4.4 Analyse mittels Western-Blot/Immunfärbung

Nach einer erfolgreichen Intergration des Zielgens (SOD, NMT) ins Genom der Versuchpflanze ist wieder nötig, die von diesen Genen synthesierten Proteine und ihre Akkumulation nachzuweisen und zu detektieren. Die DNA-Erbinformationen wurden in mRNA gespeichert und mittels Ribosomen in bestimmte Proteine umgewandelt. Dies ist als Translation bekannt (Hellwig, S., J. Drossard, et al. 2004). Isoforme des Proteins spielen eine wesentliche Rolle, da nur eine bestimmte Isoform dieser Proteine gegen den Parasiten D.Viviparus wirken können. Deswegen wurde ein SDS-PAGE eingesetzt, um mehr information über Isoforme des Proteins zu bekommen. Da die beiden Proteine, sowohl SOD als auch NMT, mit Hilfe von 6xHis-tag detektiert werdenund diese Antikörper verfügbar waren, wurde ein Western-Blot durchgeführt. Nach dem Transfer sind die Proteine für die Behandlung mit verschiedenen Antikörpern, Lectinen, Enzymsubstraten oder Liganden zugänglich. Deswegen bietet die Verwendung der Blotting-Methode nicht nur die Identifikation bestimmter Proteine, sondern auch quantitative und qualitative Bestimmungen gezielter Proteine in einem Proteingemisch (Hawkes, 1982). In diesem Experiment wurden in einem Western-Blot Proteine aus nicht-transgenen (Negativkontrolle), transgenen Tabakpflanzen und eine His-positive Kontrolle mit einem Anti-His(C-term)- AP (Alkaline Phosphatase) Antikörper untersucht. Alle Negativkontrollen oder Proben nicht-transgener Tabakpflanzen haben erwartungsgemäß keine sichtbaren Banden aufgewiesen. Bei SOD-transgenen Tabakpflanzen wurde wie erwartet auf der PVDF-Membran eine Akkumulation des SOD-Proteines mit einer Größe von ~ 19 kDa detektiert und nachgewiesen (s.Abb. 18;18.1 und 20). Bei NMT-transgenen Tabakpflanzen wurde eine Akkumulation des NMT-Proteines mit einer Größe von ~ 36 kDa zwischen 35 und 40 kDa detektiert (s.Abb.19). Da hier keine Bande bei den Negativkontrollen bemerkt wurden und nur bei NMT-transgenem Tabak, wurden diese Banden zwischen 35-40 kDa als NMT- Proteien betrachtet und ihre Ungenauigkeit wurde wegen des 6xhis-Antikörpers geklärt. Für die genauen Ergebnisse spielte der Antikörper eine wesentliche Rolle, da 6xhis-tag nicht ganz spezifisch für NMT-Proteine ist und die spezifischen Antikörper für NMT waren aufgrund finanzieller Schwierigkeiten nicht verfügbar. Durch die sichtbaren Banden bei SOD ~ 19 kDa und NMT ~ 36 kDa konnte festgelegt werden, dass die Tabakpflanzen sowohl SOD, als auch NMT-Gene exprimiert haben. Bei C. elegans als anderem Expressionsystem für die rekombinanten Proteine wird die zu D. viviparus eine mitochondriale Mn-SOD und homologe extrazelluläre Zn-SOD in der dauer larva in deutlichem Maße transkribiert ( Tawe et al.1998; Jones et al. 2001; Strube, 2004). Die Superoxiddismutase (SOD) dient bei parasitischen Nematoden wie D.viviparus der Abwehrsystem,spielt für den Parasiten eine wesentliche Rolle, um im Wirt weiter überleben zu können (Knoxu. Jones, 1992) und wird als „immune defense protein“ bezeichnet (Brophy et al., 1995). Alle Pflanzenproben, die nach Abschluß der SDS-PAGE und Western-Blot auch mit Coomassie Blue angefärbt wurden, stimmtenmit dem Ergebnis des Western-Blots überein (s.Abb. 19 B und 20 B).

4.5 Analyse der Enzyme-Assay

Über verschiedene Testsysteme für SOD-Aktivität ist bereits berichtet worden: einschließlich der Autoxidation von Adrenalin, die Reduktion von Cytochrom C und die Autoxidation von 6-Hydroxydopamin (Masayasu and Hiroshi 1979). Das AssaySystem in dieser Arbeit bestand hauptsächlich aus drei Komponenten: (1) Erzeugung von Superoxid-Anionen durch die Xanthinoxidase bei der Anwesenheit von Sauerstoff, (2) Detektion Phase: hier wird das farblose Substrat wegen der neu produzierten Superoxid-Anionen zu einem gelbfarbigen Substrat entwicklt. (3) Dieses farbige Subsrate wird anschließlich bei 450 nm gelesen und die SOD-Werte im Vergleich zu Blank- und Standard-Werten berechnet und beurteilt.

Nach einer Reihe von Untersuchungen am Zielgen auf verschiedenen Ebene, fing mit LP-Test, DNA-Ebene, RNA-Ebene und Protein-Ebene an. Schließlich ist ein sehr wichtiger weiterer Aspekt dieser Arbeit, noch das Zielgen auf Enzym-Ebene zu testen, um festzustellen, dass das Zielgen in allen Ebenen vorhanden war und in welchem Aktivitätsniveau es in den Tabakzellen existiert. Generell spielt SOD eine sehr wesentliche Rolle beim Schutz lebender Zellen vor dem toxischen Sauerstoff durch Dismutierung von Superoxid-Radikalen 2O-² in Sauerstoff (O2) und H2O2 (Sun et al., 1988).

In dieser Arbeit wurde neben dem Standard auch eine Reihe von Proteinproben der transgenen-Tabakpflanzen und zwei Proben aus nicht transgenen-Tabakpflanzen als Kontrolle (s.Abb.21 und 22) hergestellt. Da das SOD enzymatische System aus drei Isoenzymen (Cu/Zn SOD, FeSOD und MnSOD) besteht, wurde versucht zu überprüfen, welche Isoenzyme von den drei vorhanden sind (Corpas et al., 2006). Mehrere Formen von SOD wurden in Pflanzenspezies wie z.B. Zea mays gefunden, der wenigstens ein Isoenzyme des SOD Enzymsystems aufweist, diese Pflanzen enthalten eine Reihe von Genen, die für jedes Isoenzym des SOD-Gens kodieren können. Dagegen gibt es eine Reihe von höheren Pflanzen wie z.B. Sonnenblumenöl, die ein Gen oder Gene enthalten, welche nur ein einziges Isoform wie Cu / ZnSOD kodiert. Also, die Zahl der Gene, die für eine oder mehrere Isoformen kodieren, können je nach Pflanzenart und Alter geändert werden (Corpas et al., 2006). Deswegen wurden die gleichen Proteinproben mit Kaliumzyanidlösung (KCN) als spezifischem Inhibitor für Cn/Zn SOD und anderen extrazellulären SOD und mit (NaNH3) als unspezifischem Inhibitor für alle Isoenzyme des SOD Enzymsystems gemischt (Gillissen et al., 1999). Alle Proben zeigten keine SOD- Aktivität nach der Behandlung mit KCN und NaNH3 [s.Abb 21, Proben A(9,10) und Proben A(11,12); Abb. 22, Proben A(9,10)], was bedeutet, dass nur Cu/Zn SOD vorhanden ist, da mit spezifischem Inhibitor für Cn/Zn SOD alle anderen Proben gehemmt wurden.

85 % der untersuchten Proteinproben haben eine hohe bis mittelhohe SOD-Aktivität aufgewiesen (Abb. 21 und 22) und 15 % davon haben eine sehr niedrige SOD- Aktivität [Abb. 22, Probe E(7,8) oder Abb. 21, Probe A(7,8)]. Diese Proteinproben haben sowohl mit KCN, als auch mit NaNH3 keine SOD-Aktivität nachgewiesen, was deutlich darauf hinweist, dass die gemessene Aktivität auf das SOD-Enzym zurückkehrt und nicht auf andere Enzyme, die vielleicht in unseren Proben existieren könnten. Die Proteinproben aus nicht transgenen-Tabakpflanzen in diesem Versuch dienten vor allem dem Nachweis, dass die SOD-Aktivität hochwahrscheinlich aus unserem Zielgen (SOD) stammte und nicht aus einem SOD-Gen, welches vielleicht ursprünglich in Tabak existiert. Es wurde schon berichtet, dass die Tabakpflanze alle drei Isoenzyme des SOD Enzymsystems enthält (Van Campa und Van Montagua 1997). Da diese Proben (Kontrolle) keine Aktivität gezeigt haben [Abb. 21, Proben G und H(3,4); Abb. 23, proben G und H(7,8)], wurde angenommen, dass die SOD- Aktivität nicht aus einem ursprünglichen Tabak-Gen stammte, sondern aus dem transformierten Gen.

4.6 Fazit und Ausblick

Auf dem Weg zur Entwicklung und Herstellung eines „plant-based“ Impfstoffs als eine Anwendung von Pharma-Pflanzen wurden vor dem Beginn dieser Arbeit zwei Gene, nämlich das für eine extrazelluläre Superoxiddismutase (SOD) und das für Phenylethanolamin-N-Methyltransferasen (PNMT) in Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum L.) transformiert. Für diesen Zweck wurden die Vektoren mit SOD und NMT (pGIIMH35S-NMT-HIS Vektor ca. 6322 bp und pGIIMH35S- SOD Vektor ca. 6090 bp) konstruiert. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung der Impfstoffkandidaten extrazelluläre Superoxiddismutase und Phenylethanolamin-N- Methyltransferasen gegen Dictyocaulus viviparus, den großen Lungenwurm des Rindes, sowie der immunogenen Prüfung dieser Proteine. Die Impfstoffkandidaten SOD und NMT zeigten bei E. coli eine toxische Wirkung. Deswegen wurden sie in der Tabakpflanze mit Agrobacterium tumefaciens transformiert. Der Weg zur Impfstoffentwicklung begann mit der Überprüfung der Transformation: Die transformierte Tabakpflanze enthält ein Bar-Gen, welches gegen Basta Herbizid resistent ist. Es folgte der Nachweis der entsprechenden Gensequenzen im Genom der Tabakpflanze. An den Pflanzen, die schon die gezielten Gene intergriert hatten, wurden dann die gewünschten Proteine durch Westen-Blot nachgewiesen und ihre Enzymaktivität wurde gemessen.

Eine hohe bis mittelhohe Enzym-Aktivität wurde in dieser Arbeit nachgewiesen. Diese Enzyme könnten weiter für die Untersuchung an Rindern angewendet werden. Als nächster Schritt könnte auch daran gearbeitet werden, die homozygoten Linien zu etablieren. Da die Expressionstabilität dieser Gene und die davon synthesierten Proteine nicht ganz klar ist, sollte dies in nächsten Generation untersucht werden. Unter Stressbedingungen wie Schwermetallbelastung könnte beobachtet werden wie ROS sich zu einem Niveau erhöhen kann, in dem Schaden bei den Pflanzen verursacht wird. Die Akkumulation von ROS mit Superoxid-Radikalen, die normalerweise relativ unreaktiv sind, aber in Gegenwart von Metallen einigen Schaden für die zellulären Komponenten bilden können. (Bowler et al., 1992). Deswegen könnten die Tabakpflanzen im Gewächshaus mit Aluminium behandelt werden, was vielleicht die SOD-Konzentration erhöhen wird.

Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich eidesstattlich, dass die vorliegende Arbeit von mir selbst und ohne fremde Hilfe verfasst und noch nicht anderweitig für Prüfungszwecke vorgelegt wurde.

Es wurden keine als die angegebenen Quellen oder Hilfsmittel benutzt. Wörtliche und sinngemäße Zitate sind als solche gekennzeichnet.

Hamza Mohammad Hannover, 26.09.2013

Danksagung

Jede Masterarbeit trägt die Handschrift des Erstellers, und doch ist sie niemals die Arbeit eines Einzelnen. Meinem Professor Herrn Hans-Jörg Jacobsen danke ich für die wissenschaftliche Unterstützung und die immer neuen wegweisenden und konstruktiven Vorschläge.

Meinem Betreuer Herrn Fathi Hassan bin ich für seine bereichernden Ausführungen, seine vielfältigen thematischen Anregungen, seine Hilfsbereitschaft und Geduld dankbar.

Weiterhin danke ich meinen Kommilitonen und Freunden Hana, Franzy, Violetta, Ole, Linda, Alemayehu und Ciwan, ohne euch hätte diese Arbeit nicht den Variantenreichtum entwickelt, der sie heute sicher auszeichnet.

Daneben gilt mein Dank der Friedrich-Ebert-Stiftung für die Finanzierung meiner Masterarbeit.

Schließlich gebührt besonderer Dank Ala und meiner Familie, die zu jeder Zeit an mich geglaubt hat und die mich in dieser spannenden Phase meiner beruflichen Laufbahn mit unendlicher Geduld und mit liebevoller Fürsorge auf dem richtigen Weg gehalten hat. Ihnen gilt mein besonderer Dank.

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Anhang 1: Zusammenfassung der PCR-Ergebnisse und des Leaf paint-Tests der T1- Generation der transgenen Tabakpflanzen (NMT). An allen Tabakpflanzen in Gewächshauswurde der LP-Test durchgeführt. Keine sichtbare Veränderung an die behndelten Pflanzen bedeutet, dass die positive sind und werden als Plus (+) bezeichnet. Dagegen sind alle Pflanzen negative , die eine sichtbare Veränderungen nach der Behnadlung mit dem Herbizid gezeigt haben und als Mius (-) bezeichnet. Bei jeder Pflanzen wurde die PCR gegen Tef1, SOD und NMT durchgeführt. Falls das Zielgen vorhand ist, wurde als Plus (+) bezeichnet. Die Pflanzen, die das Zielgen nicht enhalten, wurden als Minus (-) bezeichnet. Von allgemein 33 Pflanzen waren 19 NMT positive und 14 Negative.

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Anhang 2: Zusammenfassung der PCR-Ergebnisse und des Leaf paint-Tests der T1-

Generation der transgenen Tabakpflanzen (SOD). Von allgemein 60 Pflanzen waren 38 SOD positive und 22 negative

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Anhang 3: Zusammenfassung der PCR-Ergebnisse und des Leaf paint-Tests der T2- Generation der transgenen Tabakpflanzen (NMT)

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Anhang 4: Zusammenfassung der PCR-Ergebnisse und des Leaf paint-Tests der T2- Generation der transgenen Tabakpflanzen (SOD)

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Anhang 5: PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder (A) Spectra™ Multicolor Broad Range Protein Ladder (B) MBI Fermentas, Deutschland

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