Abkürzungsverzeichnis
Zusammenfassung
Einleitung
Theoretischer Teil
1. Inhaltsstoffe der Erdbeere
1.1. Primärstoffwechsel
1.2. Phenylpropanstoffwechel und Flavonoid-Biosynthese
1.3. Anthocyane
1.4. Flavonole
1.5. Hydroxyzimtsäuren und Hydroxybenzoesäuren
2. Aufgabenstellung
3. Material und Methoden
3.1. Material
3.1.1. Chemikalien
3.1.2. Pflanzen
3.2. Verwendete Geräte
3.2.1. LC-MS Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie
3.2.2. Sonstige Geräte
3.3. Software
3.4. Methoden
4. Ergebnisse
4.1. Bekannte Metabolite
4.1.1. Hydroxybenzoesäure-Glucoseester
4.1.2. Ferulasäure-Glucoseester
4.1.3. p-Cumaryl-D-Glucoseester
4.1.4. Zimtsäure-Glucoseester
4.1.5. Sinapyl-Glucoseester
4.1.6. Kaffeesäure-Glucoseester
4.2. Unbekannte Metabolite
4.2.1. M301
4.2.2. M215
4.2.3. M451
4.2.4. M277
4.2.5. M449
4.2.6. M476
4.2.7. M563
4.2.8. M599
5. Diskussion
Literatur
Anhang
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Pflanzliche Glycosyltransferasen katalysieren die Übertragung eines aktivierten Zuckermoleküls auf eine Vielzahl verschiedener Verbindungen. Dabei spielen sie eine entscheidende Rolle bei der Biosynthese von Sekundärmetaboliten, sind am pflanzlichen Abwehrmechanismus beteiligt und regulieren die Konzentration wichtiger Pflanzenhormone. Biotechnologisch können Glycosyltransferasen zur Produktion physiologisch bedeutender Glycoside eingesetzt werden (Griesser, 2006: 1).
Der Transfer von Glucose ist quantitativ gesehen die wichtigste Reaktion auf der Erde (Coutinho et al., 2003). Enzyme können entsprechend der katalysierten Reaktion und ihrer Substratspezifität gemäß der Nomenklatur der International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) eingeordnet werden (Campbell et al., 1997).
Glycosyltransferasen gehören zur Klasse EC 2.4.x.y. Eine exakte Einteilung ist aber oft nicht möglich, da viele potentielle Glycosyltransferasen nicht vollständig biochemisch charakterisiert wurden oder viele Enzyme mehrere Substrate akzeptieren (Coutinho et al., 2003). Deshalb werden Glycosyltransferasen nach Substratspezifität und Sequenzhomologien geordnet (Campbell etal., 1997; Coutinho et al., 2003).
Pflanzliche Glycosyltransferasen katalysieren die Übertragung eines aktivierten Zuckermoleküls auf viele verschiedene Akzeptoren (Vogt und Jones, 2000). In Abbildung 1 ist beispielhaft die Glucosylierung des Anthocyanidins Pelargonidin durch eine Glucosyltransferase aus Erdbeerfrüchten dargestellt. Das entstehende Pelargonidin-3-glucosid ist der wichtigste Farbstoff der Erdbeerfrucht (Bakker et al., 1994).
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Abb. 1: Glucosylierung von Pelargonidin durch die Glucosyltransferase FaGT1 aus Erdbeerfrüchten. Das Enzym überträgt ein Molekül D- Glucose des aktivierten Zucker-Donors Uridindiphosphat-D-Glucose (UDPG) auf die Hydroxygruppe 3 des Pelargonidin.
Als Substrate kommen Sekundärmetabolite wie Flavonoide, Phenylpropanoide, Terpene, Cyanhydrine und Alkaloide in Frage (Vogt und Jones, 2000). Die meisten Glycosyltransferasen weisen keine strikte Substratspezifität für das Akzeptormolekül auf, sind eher regiospezifisch und katalysieren die Übertragung des Zuckers auf eine oder wenige definierte Positionen. Dagegen besteht für den Zuckerdonor eine hohe Spezifität. Die meisten Glycosyltransferasen akzeptieren bevorzugt UDP-D-Glucose.
Die Erdbeere ist einer der beliebtesten Früchte weltweit und stellt eine reichhaltige Quelle an Phytochemikalien dar. Aufgrund ihres ernährungsphysiologischen Wertes und ihrer sensorischen Eigenschaften wird sie sehr geschätzt (Zorilla-Fontanesi et al., 2011).
Erdbeeren gehören zu der Gattung Fragaria in der Familie der Rosaceae (Hancock, 1999). Die Walderdbeere F. vesca ist in Europa die heimische Wildform und zeichnet sich durch ihre tiefrote Farbe und ihr intensives Aroma aus. Die wichtigste Erdbeere ist heute die Kulturerdbeere F. x ananassa (Hancock, 1999). Sie entstand aus einer zufälligen Kreuzung der amerikanischen Wildformen F. chiloensis und F. virginiana und bekam von dem französichen Botaniker Antoine Nicholas Duchesne den Namen Ananaserdbeere. Seit Beginn des 19. Jahrhunderts werden F. x ananassa Sorten kommerziell gezüchtet, sodass über 600 verschiedene Sorten bekannt sind, die sich in Größe, Aussehen, Geruch und Geschmack der Früchte unterscheiden (Hancock, 1999; Horvath et al., 1996).
Reife Erdbeerfrüchte von F. x ananassa besitzen einen Brennwert von ca. 30kcal pro 100 g Frischgewicht und bestehen zu ca. 90% aus Wasser und 10% aus gelösten Verbindungen (Hancock, 1999). Je nach Sorte kann der Wassergehalt zwischen 88 und 94% variieren. Die wichtigsten Zucker sind D-Glucose (2%) und D-Fructose (2%), die in etwa den gleichen Teilen vorliegen und zusammen etwa 40% der Trockenmasse ausmachen. Weitere Inhaltsstoffe sind Ballaststoffe (1,5%, v.a. Pektin), organische Säuren (1,5%, v.a. Zitronensäure), Protein (0,8%) und Fett (0,4%). Der wichtigste Mineralstoff ist Kalium (Souci et al., 2008; Giampieri et al., 2012).
Das Aroma reifer Erdbeerfrüchte besteht aus ca. 360 flüchtigen Verbindungen (Latrasse, 1991; Zabetakis und Holden, 1997), von denen etwa 15 entscheidend zum Aroma beitragen (Schieberle und Hofmann, 1997), darunter sind 2,5-Dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanon (DMHF), 2,5-Dimethyl-4-methoxy-3(2H)-furanon (DMMF), (Z)-3-Hexenal, Methylbutanoat, Ethylbutanoat, Ethylhexanoat, Diacetyl und Linalool (Larsen und Poll, 1992; Schieberle und Hofmann, 1997). Der Beitrag der einzelnen Verbindungen zum Gesamtaroma variiert je nach Sorte (Larsen et al., 1992).
Neben dem Aroma zählt die rote Farbe der Erdbeeren zu den qualitätsbildenden Merkmalen.
Diese wird durch Anthocyane hervorgerufen, wovon in F. x ananassa Pelargonidin-3- glucosid den größten Anteil (90%) ausmacht.
Des Weiteren wird die Erdbeere aufgrund ihres Gesundheitswertes sehr geschätzt, da sie einen hohen Gehalt an Vitamin C (etwa 100 mg pro 100 g Frischgewicht) und Folsäure (etwa 25µg pro 100g Frischgewicht) aufweist (Souci et al., 2008; Giampieri et al., 2012). Zusätzlich enthalten Erdbeeren viele verschiedene Polyphenole, deren antioxidative Eigenschaften oft in Verbindung mit der Verringerung koronarer Herzkrankheiten gebracht werden (Törrönen und Määttää, 2002; Hannum, 2004).
Primärmetabolite, wie Kohlenhydrate, Fettsäuren und Aminosäuren, kommen in allen Pflanzen vor und erfüllen dort immer die gleichen Aufgaben. Neben den Primärmetaboliten bilden die Pflanzen aber auch Sekundärmetabolite, wie Alkaloide, Isoprenoide, Anthocyane, Flavonole und Phenylpropanoide. Diese haben keine Funktion im Primärstoffwechsel und sind in den jeweiligen Pflanzen spezifisch. Sie haben dort genau definierte ökologische Aufgaben inne, wie zum Beispiel das Anlocken von Insekten oder den Schutz vor Fressfeinden (Forkmann und Martens, 2001; Davies et al., 2006). Die große Vielfalt der von Pflanzen synthetisierten Sekundärmetabolite wird vor allem durch Modifikation des Grundgerüsts mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen erreicht (Jones und Vogt, 2001). Dabei spielt die enzymatische Übertragung von Carboxy-, Hydroxy-, Methoxygruppen und Zuckern eine entscheidende Rolle. So gibt es beispielsweise allein von Quercetin über 300 unterschiedliche Glycoside und über 5000 verschiedene Flavonoide. Diese hohe Anzahl an Sekundärmetaboliten ermöglicht den Pflanzen eine flexible Anpassung an verschiedene Umwelteinflüsse (Bowles et al., 2006).
Phenolische Substanzen sind im gesamten Pflanzenreich weit verbreitet und stellen die vielfältigste Gruppe pflanzlicher Sekundärmetabolite dar (Pereira et al., 2009). Über 8000 phenolische Strukturen sind derzeit bekannt (Dai und Mumper, 2009). Ihr Spektrum reicht von einfachen Molekülen wie Phenylpropansäuren bis hin zu hochpolymeren Netzwerken wie Tanninen oder Ligninen (Ververidis et al., 2007).
Aus dem Phenylpropanstoffwechsel lassen sich die in Erdbeeren vorkommenden Anthocyane, Flavonole, Hydroxybenzoesäuren und Hydroxyzimtsäuren ableiten (Forkmann und Martens, 2001). Dabei ist der Ausgangspunkt die Aminosäure Phenylalanin, die über den Shikimatweg gebildet wird. Die PAL (Phenylalanin-Ammoniak-Lyase) katalysiert die Abspaltung von Ammoniak und die Bildung von Zimtsäure. Aus Phenylpropanen werden durch Abspaltung eines C2-Fragmentes Benzoesäurederivate gebildet. Dann bildet die CHS (Chalcon-Synthase) das Grundgerüst der Flavonoide aus einem Molekül 4-Cumaryl-CoA und drei Molekülen Malonyl-CoA. Die wichtigsten Substrate für die Hydroxylierung des B-Rings sind Naringenin und Dihydrokämpferol. Einen weiteren Verzweigungspunkt stellen Dihydroquercetin und Dihydrokämpferol dar. Durch die FLS (Flavonol-Synthase) entstehen die entsprechenden Flavonole, während die DFR (Dihydroflavonol-4-Reduktase) und die ANS (Anthocyanidin- Synthase) zur Bildung der Anthocyanidine führen. Sowohl Anthocyanidine als auch Flavonole werden anschließend durch Glycosyltransferasen (GT) glycosyliert.
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Abb. 2: Schematische Darstellung der Biosynthese der Flavonoide
Erdbeeren enthalten ausschließlich Glycoside der Anthocyanidine Pelargonidin und Cyanidin. Neben dem wichtigsten Farbstoff Pelargonidin-3glucosid (ca. 90%) wurden auch geringe Mengen Cyanidin-3-glucosid (4%) und andere Glycoside von Pelargonidin nachgewiesen. Die Konzentration der Anthocyane ist insgesamt geringer als in anderen, stärker gefärbten Früchten wie zum Beispiel in Brombeeren und schwanken relativ stark von Sorte zu Sorte (Wang und Lin, 2000).
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Abb.3: Strukturformel und Substitutionsmuster der Anthocyane
Der Gehalt an Flavonolen ist in den verschiedenen Erdbeersorten stark unterschiedlich (Mikkonen et al., 2002). Quercetin und Kämpferol sind in der Regel am häufigsten vorhanden (Häkkinen und Törrönen, 2000). Erdbeerfrüchte weisen ein komplexes Flavonolglycosidmuster auf. In der Literatur wurden beispielsweise sieben verschiedene Glycoside von Kämpferol beschrieben (Macheix et al., 1990). Ryan (1971) erkannte 3- glucoside und 3-glucuronide von Kämpferol und Quercetin sowie Kämpferol-3-glucosid. Henning (1981) erklärte, dass lediglich Glycoside von Kämpferol und Quercetin in Erdbeerfrüchten vorkommen. Als Hauptglycoside erkannte er 3-glucuronide, 3-glucoside und 3-xylosylglucuronide.
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Abb.4: Strukturformel und Substitutionsmuster der Flavonole.
In vielen Früchten kommen Hydroxyzimtsäuren und Hydroxybenzoesäuren mit D-Glucose konjugiert vor.
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Abb. 5: Strukturformeln und Substitutionsmuster von Benzoesäure und Zimtsäure.
In Erdbeerfrüchten dominiert mengenmäßig p-Cumaroylglucose. An Hydroxybenzoesäure- Verbindungen wurde vor allem p-Hydroxybenzoesäure-Glucosid nachgewiesen (Abb. 5).
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Abb.6: Hydroxyzimtsäure- und Hydroxybenzoesäure-Verbindungen in Erdbeerfrüchten (Herrmann, 1989)
Eine weitere Untersuchung zeigte, dass auch Sinapinsäure- und Zimtsäureglucose-Ester in Erdbeerfrüchten vorkommen und die Konzentration von Glucose-Estern von Kaffeesäure, Zimtsäure und p-Cumarsäure während der Fruchtreifung ansteigt (Lunkenbein et al., 2006)
Grießer (2006) beschrieb in seiner Dissertation die funktionelle Charakterisierung von Glycosyltransferasen der Erdbeerfrucht F. x ananassa und stellte dabei fest, dass in vitro die rekombinante FaGT5 bevorzugt Hydroxyzimtsäuren und Hydroxybenzoesäuren als Substrate akzeptiert. Die höchste Umsatzrate zeigten die Substrate mit mindestens zwei Hydroxy- oder Methoxygruppen. Das beste getestete Substrat rekombinanter FaGT5 war Kaffeesäure, gefolgt von Ferulasäure, Sinapinsäure, Vanillinsäure (Grießer, 2006:65f).
Da Hydroxyzimtsäuren und Hydroxybenzoesäuren sowohl an der Hydroxy- als auch an der Säuregruppe glucosyliert werden können, wurde die Reaktion von Kaffeesäure mit UDP-D- Glucose näher betrachtet. Durch alkalische Hydrolyse konnte Grießer (2006) zeigen, dass Kaffeesäureglucose-Ester entsteht und nicht das entsprechende Glucosid. Dies hat Konsequenzen für die funktionelle Bedeutung der FaGT5. Im Gegensatz zu Glucosiden sind Glucose-Ester von Hydroxyzimtsäuren energiereichere Verbindungen mit einem hohen Gruppenübertragungspotential (Grießer, 2006:91). Diese können als Vorstufe für verschiedene Sekundärmetabolite betrachtet werden (Lunkenbein et al., 2006a). Aufgrund der phylogenetischen Analyse testete Grießer (2006) zunächst Hydroxybenzoe- und Hydroxyzimtsäuren als Substrate. Sowohl mit Hydroxyzimtsäuren als auch mit Hydroxybenzoesäuren konnte eine Produktbildung nachgewiesen werden.
Im Rahmen dieser Arbeit sollen neue Erkenntnisse über die Glycosyltransferasen der Erdbeerfrucht gewonnen werden. Dabei stehen die Auswirkungen der Herabregulation der FaGT5 im Sekundärstoffwechsel im Fokus dieser Arbeit.
Dazu wurden nach der Extraktion der Versuchsproben mittels LCMS Metabolite bestimmt. Aus den erhaltenen Datensätzen wurden anhand der Agilent 6300 Series IonTrap LC/MS System Software QuantAnalysis und DataAnalysis bekannte und unbekannte Metabolite identifiziert und die Auswirkungen der Herabregulation der FaGT5 beurteilt. Im Vordergrund standen hierbei die Sekundärmetabolite Zimtsäure-Glucoseester, p-Hydroxybenzoesäure- Glucoseester, Kaffeesäure-Glucoseester, p-Cumaryl-D-Glucoseester und SinapylGlucoseester als bekannte Metabolite und weitere unbekannte Metabolite.
- Interner Standard: 20 mg Biochanin A und 20 mg 4-Methylumbelliferyl-β-D- Glucuronide in 100 ml Methanol gelöst
- Methanol CH3OH, M: 32,04g/mol, Baker Analyzed LC-MS Reagent, J.T. Baker (Deventer, Niederlande)
- Biochanin A Hersteller: Sigma-Aldrich
- 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid Dihydrat (MUG); ≥ 99%, p. a., M 388.33 g/mol; Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe, Art.-Nr. 6394,2 (250 mg
- Destilliertes Wasser: Baker Analyzed LC-MS Reagent, J.T. Baker (Deventer, Niederlande)
- Erdbeeren der Gattung F. x ananassa
In den genetisch modifizierten Früchten waren Gene des Flavonoidstoffwechsels durch RNA-Interferenz herabreguliert worden entsprechend Hoffmann et al., 2006
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
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