Expression, Aufreinigung und Kristallisation des nicht-strukturellen Proteins 8 (nsp8) aus dem SARS-Coronavirus

Inhaltsverzeichnis

1. Zusammenfassung

2. Einleitung

2.1 Coronaviren

2.2 SARS coronavirus und Replikationsstrategie

2.3 Zielsetzung

3. Materialien und Methoden

3.1 Materialien

3.1.1 Chemikalien

3.1.2 Geräte

3.2 Methoden

3.2.1 Expression von nsp8

3.2.1.1 Expression der Vorkultur

3.2.1.2 Induktion und Überexpression von nsp8

3.2.1.3 Ernte und Aufschluss der E. coli Zellen

3.2.2 Aufreinigung von nsp8

3.2.2.1 Aufreinigung mittels NiNTA Affinitätssäule

3.2.2.2 Elution des Nicht-Struktur Proteins8(nsp8) von der NiNTA Affinitätssäule

3.2.2.3 Einengen des Probenvolumens durch Amicon® UFZ

3.2.2.4 Aufreinigung des nsp8 durch Gelfiltration (Grössenfraktionierung)

3.2.2.5 SDS-PAGE

3.2.2.6 Bestimmung der Proteinkonzentration

3.2.2.7 Aufkonzentrierung der nsp8 Proteinlösung

3.2.3 Kristallisation von nsp8

3.2.3.1 Phasendiagramm

3.2.3.1.1 Löslichkeitskurve (Solubility Curve)

3.2.3.1.2 Metastabile Zone (Metastable Zone)

3.2.3.1.3 Nukleationszone (Nucleation Zone)

3.2.3.1.4 Präzipitationszone (Precipitation Zone)

3.2.3.2 Kristallisation mittels Verdunstungsdiffusion am hängenden Tropfen

3.2.3.3 Kristallisation mittels Verdunstungsdiffusion am sitzenden Tropfen

3.2.3.4 Bestimmung der Löslichkeitsgrenze für (NH4)2SO4, PEG 6k und NaCl

3.2.3.5 Kristallisationsexperimente (Allgemein)

3.2.3.6 Kristallisation von nsp8

3.2.3.7 Überprüfung der Kristalle

4. Ergebnisse und Diskussion

4.1 Expression und Aufreinigung von nsp8

4.2 Kristallisation von nsp8

Zielsetzung und Themenfelder

Die vorliegende Arbeit verfolgt das Ziel, das Nicht-Struktur Protein 8 (nsp8) des SARS-Coronavirus für eine Röntgenstrukturanalyse zu kristallisieren, um dessen bislang unbekannte Funktion und mögliche Rolle bei der RNA-Bindung aufzuklären.

• Molekularbiologische Überexpression von rekombinantem nsp8 in E. coli
• Optimierung von Reinigungsverfahren mittels Affinitätschromatographie und Gelfiltration
• Systematische Untersuchung von Kristallisationsbedingungen mittels "Trial-and-Error"
• Einsatz von Seeding-Methoden zur Induktion von Nukleation und Kristallwachstum

Auszug aus dem Buch

Zusammenfassung der Kapitel

1. Zusammenfassung: Gibt einen Überblick über den SARS-Ausbruch 2003, die Biologie des Virus und die Relevanz dieser Arbeit für die zukünftige Forschung.

2. Einleitung: Beschreibt die Familie der Coronaviren, die Replikationsstrategie des SARS-Coronavirus und definiert das Ziel der Kristallisation von nsp8.

3. Materialien und Methoden: Detaillierte Auflistung der eingesetzten Chemikalien, Geräte sowie der experimentellen Abläufe von der Expression bis zur Kristallprüfung.

4. Ergebnisse und Diskussion: Dokumentation der erfolgreichen Aufreinigung von nsp8 und der durchgeführten Kristallisationsversuche unter verschiedenen Bedingungen.

Schlüsselwörter

SARS-Coronavirus, nsp8, Protein-Expression, Affinitätschromatographie, Gelfiltration, Kristallisation, Phasendiagramm, Röntgenstrukturanalyse, Nukleation, Seeding, SDS-PAGE, Proteinreinigung, virale Replikation, Metallo-Additive

Häufig gestellte Fragen

Worum geht es in dieser wissenschaftlichen Arbeit?

Die Arbeit befasst sich mit der biochemischen Charakterisierung des Nicht-Struktur Proteins 8 (nsp8) des SARS-Coronavirus, mit dem Ziel, durch Kristallisation die strukturelle Basis für das Verständnis seiner Funktion zu schaffen.

Welche zentralen Themenbereiche werden bearbeitet?

Die Schwerpunkte liegen auf der Überexpression des Proteins, dessen mehrstufiger Aufreinigung und der methodischen Suche nach geeigneten Bedingungen für die Proteinkristallisation.

Was ist das primäre Forschungsziel?

Das Ziel ist die Erlangung hochreiner nsp8-Kristalle als Voraussetzung für eine Röntgenstrukturanalyse, um potenzielle Bindungsstellen oder Funktionen, insbesondere bei der RNA-Interaktion, zu identifizieren.

Welche wissenschaftlichen Methoden kommen zum Einsatz?

Es wurden molekularbiologische Standardverfahren zur Expression, Affinitätschromatographie (NiNTA), Gelfiltration, SDS-PAGE zur Reinheitsprüfung sowie diverse Kristallisationstechniken (Verdunstungsdiffusion, Seeding) genutzt.

Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?

Der Hauptteil gliedert sich in die detaillierte Beschreibung der Proteinaufreinigung sowie der umfangreichen Versuchsreihen zur Kristallisation unter Variation von Parametern wie pH-Wert, Temperatur und Additiven.

Welche Begriffe charakterisieren die Arbeit am besten?

Neben den technischen Begriffen wie NiNTA-Chromatographie und Gelfiltration sind insbesondere SARS-Coronavirus, nsp8-Protein, Kristallisations-Screening und Seeding-Methoden zentrale Begriffe.

Warum ist eine so hohe Proteinreinheit für die Kristallisation notwendig?

Verunreinigungen durch andere Proteine oder Partikel stören die Ausbildung eines geordneten Kristallgitters und verhindern somit die erfolgreiche Röntgenstrukturanalyse.

Welche Herausforderung stellte sich bei der Kristallisation des nsp8?

Die größte Herausforderung war die Induktion einer kontrollierten Nukleation, wobei oft entweder amorphe Präzipitate oder gelartige Strukturen auftraten, die durch weitere Optimierungen der Puffer und Additive überwunden werden mussten.