Expression, Aufreinigung und Kristallisation des nicht-strukturellen Proteins 8 (nsp8) aus dem SARS-Coronavirus

Inhaltsverzeichnis

• Zusammenfassung
• Einleitung
• Coronaviren
• SARS coronavirus und Replikationsstrategie
• Zielsetzung
• Materialien und Methoden
• Materialien
• Chemikalien
• Geräte
• Methoden
• Expression von nsp8
• Expression der Vorkultur
• Induktion und Überexpression von nsp8
• Ernte und Aufschluss der E. coli Zellen
• Aufreinigung von nsp8
• Aufreinigung mittels NiNTA Affinitätssäule
• Elution des Nicht-Struktur Proteins8(nsp8) von der NiNTA Affinitätssäule
• Einengen des Probenvolumens durch AmiconⓇ UFZ
• Aufreinigung des nsp8 durch Gelfiltration (Grössenfraktionierung)
• SDS-PAGE
• Bestimmung der Proteinkonzentration
• Aufkonzentrierung der nsp8 Proteinlösung
• Kristallisation von nsp8
• Phasendiagramm
• Löslichkeitskurve (Solubility Curve)
• Metastabile Zone (Metastable Zone)
• Nukleationszone (Nucleation Zone)
• Präzipitationszone (Precipitation Zone)
• Kristallisation mittels Verdunstungsdiffusion am hängenden Tropfen
• Kristallisation mittels Verdunstungsdiffusion am sitzenden Tropfen
• Bestimmung der Löslichkeitsgrenze für (NH4)2SO4, PEG 6k und NaCl
• Kristallisationsexperimente (Allgemein)
• Kristallisation von nsp8
• Überprüfung der Kristalle
• Ergebnisse und Diskussion
• Expression und Aufreinigung von nsp8
• Kristallisation von nsp8
• Literatur
• Abkürzungen
• Anhang (Abbildungen 19, 20 (a + b) und 21)

Zielsetzung und Themenschwerpunkte

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Expression, Aufreinigung und Kristallisation des nicht-strukturellen Proteins 8 (nsp8) aus dem SARS-Coronavirus. Die Kristallisation von nsp8 ist ein entscheidender Schritt zur Strukturbestimmung dieses Proteins, die wiederum wichtige Erkenntnisse über seine Funktion und potenzielle Rolle in der Virusreplikation liefern könnte. Der hohe Reinheitsgrad des Proteins ist eine wesentliche Voraussetzung für die erfolgreiche Kristallisation.

• Expression des nsp8 Proteins in E. coli Zellen
• Aufreinigung des nsp8 Proteins durch verschiedene chromatographische Verfahren
• Kristallisation von nsp8 unter Verwendung verschiedener Methoden
• Strukturbestimmung des nsp8 Proteins durch Röntgenkristallographie
• Aufklärung der Funktion des nsp8 Proteins

Zusammenfassung der Kapitel

Die Arbeit gliedert sich in mehrere Kapitel, die die einzelnen Schritte der Proteinproduktion und -kristallisation beleuchten.

• Zusammenfassung: Die Zusammenfassung fasst die zentralen Ergebnisse der Arbeit zusammen und stellt die Bedeutung der Forschung im Kontext des SARS-Coronavirus heraus.
• Einleitung: Die Einleitung gibt einen Überblick über die Biologie der Coronaviren, insbesondere des SARS-Coronavirus, und erläutert die Replikationsstrategie des Virus. Die Zielsetzung der Arbeit wird ebenfalls in diesem Kapitel vorgestellt.
• Materialien und Methoden: Dieses Kapitel beschreibt die verwendeten Materialien, einschließlich Chemikalien, Geräte und Verfahren. Detaillierte Informationen zur Expression, Aufreinigung und Kristallisation von nsp8 werden bereitgestellt.
• Ergebnisse und Diskussion: Die Ergebnisse der Experimente werden dargestellt und im Kontext der bisherigen Forschung diskutiert. Die Interpretation der Ergebnisse und ihre Bedeutung für die zukünftige Forschung werden ebenfalls beleuchtet.
• Literatur: Dieses Kapitel enthält eine umfassende Liste der relevanten wissenschaftlichen Publikationen, die in der Arbeit zitiert werden.

Schlüsselwörter

Die Arbeit befasst sich mit dem nicht-strukturellen Protein 8 (nsp8) aus dem SARS-Coronavirus. Wichtige Schlüsselbegriffe sind Expression, Aufreinigung, Kristallisation, Strukturbestimmung, RNA-Bindung, Drug Design, SARS, Coronaviren, Replikation.