Charakterisierung von putativen cis-aktiven RNA-Elementen in der 5'-nichttranslatierten Region des RNA-Genoms des Humanen Coronavirus 229E (HCoV-229E)

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung

1.1 Einführung

1.2 Klassifikation der Nidovirales

1.3 Morphologie der Coronavirinae

1.4 Genomorganisation und Replikation von Coronaviren

1.4.1 Genomstruktur

1.4.2 Replikation und Transkription

1.4.3 Sekundärstrukturen im UTR-Bereich

1.4.3.1 SL-Struktur 1 (SL1)

1.4.3.2 SL-Struktur 2 (SL2)

1.4.3.3 SL-Struktur 3 (SL3)

1.4.3.4 SL-Struktur 4 (SL4)

1.4.3.5 SL-Struktur 5 (SL5)

1.5 Zielsetzung

2 Material und Methoden:

2.1 Medien und Lösungen

2.1.1 Zellkulturmedium

2.1.2 TAE-Puffer (50x)

2.1.3 LB-Medium

2.1.3.1 LB-Medium + Agar

2.1.3.2 LB-Medium + Ampicillin

2.1.3.3 LB-Medium + Ampicillin + Agar

2.1.4 TE-Puffer

2.1.4.1 TE-Puffer + Saccharose

2.1.5 DNase-Puffer (10x)

2.1.6 Proteinase-K-Puffer (2x)

2.1.7 Minipräparation

2.2 Zellkultur

2.2.1 Zellen splitten

2.2.2 Zellen zählen

2.2.3.Verwendete Zelllinien

2.3 Virus

2.3.1 HCoV-229E

2.3.1.1 Transfektion

2.3.1.2 TCID50

2.3.1.3 Plaque-Test

2.3.1.4 Passagieren von HCoV-229E

2.3.2 Arbeiten mit Vacciniaviren

2.3.2.1 Virussufreinigung

2.3.2.2 DNA-Tranfektion von Vaccinia-infizierten Zellen

2.3.2.3 gpt-Negativselektion

2.4 RNA

2.4.1 RNA-Isolation

2.4.2 Quantifizierung der RNA-Konzentration

2.4.3 Reverse Transkription

2.4.4 In-vitro-Transkription

2.4.5 Auftrennung von RNA mittels Agarose-Gelelektrophorese

2.5 DNA

2.5.1 PCR

2.5.2 Auftrennung von DNA mittels Agarose-Gelelektrophorese

2.5.3 Restriktionsverdau

2.5.3.1 DpnI-Verdau

2.5.3.2 ClaI-Verdau

2.5.4 DNA-Sequenzierung

2.5.5 Plasmid-DNA-präparation (Minipräparation)

2.5.6 DNA-Fällung

2.5.7 Bestimmung der DNA-Konzentration

2.6 Bakterien

2.6.1 Transformation

2.7 Verwendete Kits

3 Ergebnisse

3.1 Stammschleife 5 (SL5) von HCoV-229E

3.1.1 Theoretischer Hintergrund

3.1.1.1 Deletionsmutanten

3.1.1.2 Single Nukleotidmutanten

3.1.1.3 Mehrfachmutante

3.1.2 Mutagenese

3.1.3 Negativselektion

3.2 SL4

3.2.1 Theoretischer Hintergrund

3.2.1.1 „Minimal“-mutanten

3.2.1.2 „Maximal“-mutanten

3.2.2 in-vitro-Transkription der Volllängen-HCoV-229E-Genom-RNA

3.2.3 Transfektion

3.2.4 TCID50-Bestimmung (Passage 0)

3.2.5 Sequenz-Analyse von SL4-Mutanten

3.2.5.1 Passage 0 #1

3.2.5.2 Passage 0 #2

3.2.6 Plaque-Test

3.2.7 Passagen 1-5

3.2.7.1 TCID50 Passage 1

3.2.8 Passage 6

3.2.8.1 Passage 6 #1

3.2.8.2 Passage 6 #2

4 Diskussion

5 Ausblick

6 Referenzen

Zielsetzung & Themen

Diese Arbeit zielt darauf ab, die Rolle putativer cis-aktiver RNA-Elemente (insbesondere der Stammschleifen SL4 und SL5) in der 5′-nichttranslatierten Region des Genoms des humanen Coronavirus 229E mittels revers-genetischer Ansätze zu untersuchen und deren Einfluss auf die virale Replikation zu charakterisieren.

• Charakterisierung von RNA-Sekundärstrukturen in der 5'-UTR von HCoV-229E
• Generierung spezifischer Virusmutanten durch Nukleotidsubstitutionen und Deletionen
• Analyse der Replikationseffizienz mittels Virustiterbestimmung (TCID50) und Plaque-Tests
• Untersuchung der genomischen Stabilität und potenzieller kompensatorischer Mutationen durch Sequenzanalysen

Auszug aus dem Buch

Zusammenfassung der Kapitel

1 Einleitung: Vermittelt grundlegende Kenntnisse über Coronaviren, deren Genomstruktur, Replikationsmechanismen und die Bedeutung konservierter Sekundärstrukturen in der UTR.

2 Material und Methoden: Beschreibt detailliert die verwendeten Zellkulturtechniken, Virusinfektionsmodelle, molekularbiologischen Methoden zur Mutagenese sowie die Analysetechniken für RNA und DNA.

3 Ergebnisse: Dokumentiert die Generierung von SL5- und SL4-Mutanten, deren Replikationsverhalten in Huh7-Zellen sowie die Sequenzanalyse zur Untersuchung von Stabilität und kompensatorischen Mutationen.

4 Diskussion: Interpretiert die experimentellen Daten hinsichtlich der strukturellen Bedeutung von SL4 und SL5 für die virale Replikation und erörtert mögliche Kompensationsmechanismen.

5 Ausblick: Schlägt weiterführende Studien vor, um die funktionelle Rolle der generierten Mutanten und die molekularen Mechanismen von long-range Interaktionen tiefergehend zu verstehen.

6 Referenzen: Listet die für diese Arbeit verwendete wissenschaftliche Fachliteratur auf.

Schlüsselwörter

Humanes Coronavirus 229E, HCoV-229E, 5'-UTR, cis-aktive RNA-Elemente, Stammschleifen, reverse Genetik, Replikation, Mutagenese, Virusmutanten, long-range Interaktionen, TCID50, Transkription, Genomstruktur, Sekundärstrukturen, RNA-Synthese.

Häufig gestellte Fragen

Worum geht es in dieser Bachelorarbeit grundsätzlich?

Die Arbeit untersucht die funktionelle Bedeutung spezifischer RNA-Strukturelemente (Stammschleifen 4 und 5) in der 5'-untranslatierten Region des Genoms von HCoV-229E.

Was sind die zentralen Themenfelder der Untersuchung?

Im Fokus stehen die Genomorganisation, die RNA-Sekundärstrukturen, die virale Replikation sowie die Auswirkungen von gezielten Mutationen auf die Lebensfähigkeit des Virus.

Was ist das primäre Ziel der Arbeit?

Das Ziel ist die Charakterisierung putativer cis-aktiver RNA-Elemente durch Destabilisierung der Strukturen und die anschließende Bewertung der Auswirkungen auf den Replikationszyklus.

Welche wissenschaftliche Methode wird primär verwendet?

Es wird ein revers-genetischer Ansatz genutzt, um gezielte Mutationen in die virale cDNA einzuführen und deren Auswirkungen mittels Zellkultur-Assays zu analysieren.

Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?

Der Hauptteil befasst sich mit der Erstellung computergestützter Vorhersagen zu Sekundärstrukturen, der praktischen Durchführung der Mutagenese sowie der virologischen und molekularbiologischen Auswertung der generierten Mutanten.

Welche Begriffe charakterisieren die Arbeit am besten?

Die Arbeit ist durch Begriffe wie Reverse Genetik, HCoV-229E, 5'-UTR, RNA-Sekundärstrukturen, Replikationskinetik und Sequenzanalyse geprägt.

Welche Bedeutung hat die SL4-Struktur für das Virus?

Die SL4-Struktur fungiert vermutlich als Spacer-Element, welches für den korrekten Abstand zwischen anderen wichtigen RNA-Strukturen während der Replikation sorgt.

Was deuten die beobachteten kompensatorischen Mutationen an?

Das Auftreten solcher Mutationen deutet darauf hin, dass das Virus versucht, durch sekundäre genetische Anpassungen die Destabilisierung der ursprünglichen RNA-Struktur auszugleichen, um die Replikationseffizienz wieder zu steigern.