Charakterisierung von putativen cis-aktiven RNA-Elementen in der 5'-nichttranslatierten Region des RNA-Genoms des Humanen Coronavirus 229E (HCoV-229E)

Inhaltsverzeichnis (Table of Contents)

• Abbildungen
• Abkürzungen
• Zusammenfassung
• Abstract
• 1 Einleitung
  • 1.1 Einführung
  • 1.2 Klassifikation der Nidovirales
  • 1.3 Morphologie der Coronavirinae
  • 1.4 Genomorganisation und Replikation von Coronaviren
    • 1.4.1 Genomstruktur
    • 1.4.2 Replikation und Transkription
    • 1.4.3 Sekundärstrukturen im UTR-Bereich
      • 1.4.3.1 SL-Struktur 1 (SL1)
      • 1.4.3.2 SL-Struktur 2 (SL2)
      • 1.4.3.3 SL-Struktur 3 (SL3)
      • 1.4.3.4 SL-Struktur 4 (SL4)
      • 1.4.3.5 SL-Struktur 5 (SL5)
  • 1.5 Zielsetzung
  • 2 Material und Methoden:
    • 2.1 Medien und Lösungen
      • 2.1.1 Zellkulturmedium
      • 2.1.2 TAE-Puffer (50x)
      • 2.1.3 LB-Medium
        • 2.1.3.1 LB-Medium + Agar
        • 2.1.3.2 LB-Medium + Ampicillin
        • 2.1.3.3 LB-Medium + Ampicillin + Agar
      • 2.1.4 TE-Puffer
        • 2.1.4.1 TE-Puffer + Saccharose
      • 2.1.5 DNase-Puffer (10x)
      • 2.1.6 Proteinase-K-Puffer (2x)
      • 2.1.7 Minipräparation
    • 2.2 Zellkultur
      • 2.2.1 Zellen splitten
      • 2.2.2 Zellen zählen
      • 2.2.3.Verwendete Zelllinien
    • 2.3 Virus
      • 2.3.1 HCOV-229E
        • 2.3.1.1 Transfektion
        • 2.3.1.2 TCID 50
        • 2.3.1.3 Plaque-Test
        • 2.3.1.4 Passagieren von HCOV-229E
      • 2.3.2 Arbeiten mit Vacciniaviren
        • 2.3.2.1 Virussufreinigung
        • 2.3.2.2 DNA-Tranfektion von Vaccinia-infizierten Zellen
        • 2.3.2.3 gpt-Negativselektion
    • 2.4 RNA
      • 2.4.1 RNA-Isolation
      • 2.4.2 Quantifizierung der RNA-Konzentration
      • 2.4.3 Reverse Transkription
      • 2.4.4 In-vitro-Transkription
      • 2.4.5 Auftrennung von RNA mittels Agarose-Gelelektrophorese
    • 2.5 DNA
      • 2.5.1 PCR
      • 2.5.2 Auftrennung von DNA mittels Agarose-Gelelektrophorese
      • 2.5.3 Restriktionsverdau
        • 2.5.3.1 Dpnl-Verdau
        • 2.5.3.2 Clal-Verdau
      • 2.5.4 DNA-Sequenzierung
      • 2.5.5 Plasmid-DNA-präparation (Minipräparation)
      • 2.5.6 DNA-Fällung
      • 2.5.7 Bestimmung der DNA-Konzentration
    • 2.6 Bakterien
      • 2.6.1 Transformation
    • 2.7 Verwendete Kits
    • Ergebnisse
    • 3.1 Stammschleife 5 (SL5) von HCOV-229E
      • 3.1.1 Theoretischer Hintergrund
        • 3.1.1.1 Deletionsmutanten
        • 3.1.1.2 Single Nukleotidmutanten
        • 3.1.1.3 Mehrfachmutante
      • 3.1.2 Mutagenese
      • 3.1.3 Negativselektion
    • 3.2 SL4
      • 3.2.1 Theoretischer Hintergrund
        • 3.2.1.1 Minimal\"-mutanten
        • 3.2.1.2,,Maximal\"-mutanten
      • 3.2.2 in-vitro-Transkription der Volllängen-HCOV-229E-Genom-RNA
      • 3.2.3 Transfektion
      • 3.2.4 TCID 50-Bestimmung (Passage 0)
      • 3.2.5 Sequenz-Analyse von SL4-Mutanten
        • 3.2.5.1 Passage 0 #1
        • 3.2.5.2 Passage 0 #2
      • 3.2.6 Plaque-Test
      • 3.2.7 Passagen 1-5
        • 3.2.7.1 TCID 50 Passage 1
      • 3.2.8 Passage 6
        • 3.2.8.1 Passage 6 #1
        • 3.2.8.2 Passage 6 #2
    • 4 Diskussion
    • 5 Ausblick
    • 6 Referenzen

    Zielsetzung und Themenschwerpunkte (Objectives and Key Themes)

    Diese Bachelorarbeit befasst sich mit der Charakterisierung von putativen cis-aktiven RNA-Elementen in der 5'-nicht translatierten Region des RNA-Genoms des Humanen Coronavirus 229E (HCOV-229E). Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Rolle dieser RNA-Elemente bei der Replikation und Transkription des Virus zu untersuchen. Hierzu wurden verschiedene Mutanten des HCOV-229E-Genoms erstellt und deren Auswirkungen auf die Virusreplikation und -transkription in Zellkultur untersucht.

    • Die Rolle von cis-aktiven RNA-Elementen in der 5'-UTR des HCOV-229E-Genoms
    • Die Auswirkungen von Mutationen in diesen RNA-Elementen auf die Virusreplikation und -transkription
    • Die Identifizierung von Schlüsselstrukturen und -funktionen dieser RNA-Elemente
    • Die Entwicklung neuer Strategien zur Bekämpfung von Coronavirus-Infektionen

    Zusammenfassung der Kapitel (Chapter Summaries)

    Das erste Kapitel bietet eine Einführung in die Welt der Coronaviren und deren Klassifikation, Morphologie und Genomorganisation. Es beleuchtet auch die Replikation und Transkription des Virus sowie die Sekundärstrukturen im UTR-Bereich. Das zweite Kapitel beschreibt die Materialien und Methoden, die in dieser Arbeit verwendet wurden. Dies umfasst Zellkulturtechniken, Virusmanipulationen, RNA- und DNA-Techniken sowie bakterielle Transformationen. Das dritte Kapitel präsentiert die Ergebnisse der Untersuchungen zu den Stammschleifen 5 (SL5) und 4 (SL4) des HCOV-229E-Genoms. Es werden die generierten Mutanten, die negativen Selektionsergebnisse sowie die Auswirkungen der Mutationen auf die Virusreplikation und -transkription beschrieben.

    Schlüsselwörter (Keywords)

    Humanes Coronavirus 229E (HCOV-229E), cis-aktive RNA-Elemente, 5'-UTR, Stammschleife, Replikation, Transkription, Mutanten, Negativselektion, Plaque-Test, TCID50.

    Häufig gestellte Fragen

    Was ist das Humane Coronavirus 229E (HCoV-229E)?

    HCoV-229E ist ein Virus aus der Familie der Coronaviridae, das beim Menschen meist milde Atemwegserkrankungen hervorruft und als Modellorganismus in der Forschung dient.

    Was sind cis-aktive RNA-Elemente?

    Dies sind regulatorische Abschnitte auf der viralen RNA, die für Prozesse wie die Replikation und Transkription des Virusgenoms essenziell sind.

    Welche Bedeutung haben die Stammschleifen SL4 und SL5?

    Diese Sekundärstrukturen im 5'-UTR-Bereich des Genoms sind vermutlich entscheidend für die virale RNA-Synthese und Interaktionen innerhalb des Genoms.

    Was wurde durch den revers-genetischen Ansatz untersucht?

    Es wurden Mutanten erzeugt, um zu prüfen, ob die Destabilisierung dieser Strukturen die Virusreplikation in Zellkulturen verhindert oder einschränkt.

    Was ist ein Plaque-Test oder eine TCID50-Bestimmung?

    Dies sind virologische Methoden zur Bestimmung der Infektiosität und der Konzentration (Titer) von Viren in einer Probe.