Produktion rekombinanter MSP119-Varianten von Plasmodium falciparum in Nicotiana tabacum zur Evaluierung als Malaria-Impfstoffkandidaten

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG

1.1 Der Lebenszyklus von Plasmodium falciparum

1.2 Blutstadien-Antigene und ihre Bedeutung für die Vakzinentwicklung

1.3 Merozoit-Oberflächen-Protein 1

1.4 MSP119 als Impfstoffkandidat

1.5 Die MSP119-spezifischen inhibitorischen mAbs 12.8 und 12.10

1.6 DsRed – Das rot-fluoreszierende Protein

1.7 Pflanzen als Expressionssysteme

1.8 Zielsetzung

2 MATERIAL

2.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien

2.2 Enzyme, Antikörper und Reaktionkits

2.3 Medien, Lösungen und Puffer

2.4 Geräte, Apparaturen und Zubehör

2.5 Vektoren

2.6 Synthetische Gene

2.7 Synthetische Oligonukleotide (Primer)

2.8 Bakterienstämme und Pflanzen

3 METHODEN

3.1 Molekularbiolgische Methoden

3.1.1 Anzucht von E. coli und Herstellung von Stammkulturen

3.1.2 Hitzeschocktransformation von E.coli

3.1.3 Kultivierung von A. tumefaciens und Herstellung von Stammkulturen

3.1.4 Elektroporation von A. tumefaciens

3.1.5 Plasmidisolation aus E. coli (Minipräparation)

3.1.6 Restriktion von DNA

3.1.7 Analytische und präparative Agarosegelelektrophorese

3.1.7.1 Analytische Agarosegelelektrophorese

3.1.7.2 Präparative Agarosegelelektrophorese

3.1.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

3.1.9 Ligation

3.1.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

3.1.11 Kolonie-PCR rekombinanter Bakterien

3.1.12 Enzymatische DNA-Sequenzierung nach Sanger

3.2 Proteinchemische und immunologische Methoden

3.2.1 Extraktion löslicher Proteine aus Pflanzenmaterial

3.2.2 Hitzefällung des Pflanzenextraktes

3.2.3 Reinigung von Proteinen mittels Affinitätschromatographie

3.2.4 Diskontinuierliche SDS-PAGE

3.2.5 Sensitive Coomasssie Blue R-250 Färbung

3.2.6 Western Blot

3.2.7 Korrelative Proteinquantifizierung mittels Fluoreszenzmessung

3.2.8 Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Messung (Biacore)

3.2.9 Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA)

3.3 Pflanzen

3.3.1 Kultivierung von N. tabacum und N. benthamiana im Gewächshaus

3.3.2 Transiente Expression in N. tabacum und N. benthamiana

3.4 Immunisierung von Mäusen mit Tabak-produziertem MSP119_3D7-DsRed

4 ERGEBNISSE

4.1 Herstellung und Charakterisierung der MSP119-Varianten

4.1.1 Konstruktion der MSP119-Expressionsvektoren

4.1.2 Temperaturstabilität von HEK- und Tabak-produziertem MSP119

4.1.3 Transiente Expression der MSP119-Proteinvarianten in N. tabacum

4.1.4 Reinigung MSP119-Proteinvarianten

4.1.5 Charakterisierung der Fusionsproteine auf dem Biacore T100-System

4.1.6 Immunisierung von Mäusen mit Tabak-produziertem MSP119_3D7-DsRed

4.2 Klonierung und Produktion chimärer Varianten der MSP119-spezifischen inhibitorischen mAbs 12.8 und 12.10

4.2.1 Konstruktion der Expressionsvektoren für die schwere und leichte Kette der chimären mABs 12.8 und 12.10

4.2.2 Transiente Expression der chimären Antikörper

4.2.3 Reinigung der chimären mAbs 12.8 und 12.10

4.2.4 Charakterisierung der gereinigten chimären Antikörper mAb 12.8 und 12.10 auf dem Biacore T100-System

5 DISKUSSION UND AUSBLICK

5.1 Charakterisierung der MSP119-Proteinvarianten

5.2 Charakterisierung der chimären mAbs 12.8 und 12.10

6 ZUSAMMENFASSUNG

Zielsetzung & Themen

Diese Arbeit zielt darauf ab, vier verschiedene MSP119-Isolate (3D7, FUP, WELLCOME und TYPE2) in Nicotiana tabacum und Nicotiana benthamiana transient zu exprimieren, um sie als Impfstoffkandidaten gegen Malaria zu evaluieren. Zusätzlich sollen chimäre Varianten von inhibitorischen monoklonalen Antikörpern (12.8 und 12.10) in Pflanzen produziert und charakterisiert werden, um deren Potenzial für Invasions-Assays zu prüfen.

• Produktion rekombinanter MSP119-Proteinvarianten in pflanzlichen Expressionssystemen
• Klonierung und Herstellung chimärer Maus-Mensch-Antikörper
• Charakterisierung mittels biochemischer und immunologischer Methoden (Biacore, Western Blot, ELISA)
• Immunisierungsstudien in Tiermodellen (BALB/c-Mäuse)

Auszug aus dem Buch

Zusammenfassung der Kapitel

1 EINLEITUNG: Einführung in die Problematik der Malaria, den Lebenszyklus des Parasiten und die Relevanz von MSP119 sowie pflanzlichen Expressionssystemen für die Vakzinentwicklung.

2 MATERIAL: Auflistung der verwendeten Chemikalien, Enzyme, Antikörper, Medien, Geräte und biologischen Stämme für die experimentelle Arbeit.

3 METHODEN: Detaillierte Beschreibung der molekularbiologischen, proteinchemischen und immunologischen Arbeitsschritte, einschließlich der transienten Expression in Pflanzen.

4 ERGEBNISSE: Darstellung der erfolgreichen Konstruktion der Expressionsvektoren, Reinigung der Proteinvarianten und chimären Antikörper sowie deren Charakterisierung mittels Biacore und Immunisierungsversuchen.

5 DISKUSSION UND AUSBLICK: Interpretation der erzielten Daten hinsichtlich der Reinheit, Stabilität und Immunogenität der produzierten Proteine und Antikörper sowie Vorschläge für Optimierungen.

6 ZUSAMMENFASSUNG: Zusammenfassender Überblick über die erfolgreiche Produktion und Charakterisierung der MSP119-Varianten und chimären Antikörper.

Schlüsselwörter

Plasmodium falciparum, MSP119, Malaria, Impfstoffkandidaten, Nicotiana tabacum, Nicotiana benthamiana, transiente Expression, Agrobacterium tumefaciens, DsRed, chimäre Antikörper, Biacore, Immunisierung, Proteinreinigung, Molecular Farming.

Häufig gestellte Fragen

Was ist das übergeordnete Ziel der Arbeit?

Die Arbeit untersucht die Eignung von Tabakpflanzen als Expressionssystem für rekombinante MSP119-Varianten und chimäre Antikörper, um diese als potenzielle Malaria-Impfstoffkandidaten zu evaluieren.

Welche Organismen werden für die Produktion genutzt?

Es werden die Pflanzenarten Nicotiana tabacum und Nicotiana benthamiana verwendet, in denen die Zielproteine mittels transienter Transformation durch das Agrobacterium-System exprimiert werden.

Warum ist MSP119 ein interessanter Impfstoffkandidat?

MSP119 ist ein stark konserviertes Fragment des Merozoit-Oberflächen-Proteins 1, das bei mehreren klinischen Studien als Teil von Vakzinkandidaten untersucht wird und als kleinstes Fragment noch einen schützenden immunologischen Effekt vermitteln kann.

Welche Methode wird zur Antikörper-Reinigung eingesetzt?

Zur Reinigung der chimären Antikörper wird die Protein A Affinitätschromatographie verwendet, bei der die Proteine an eine Protein A Matrix binden und anschließend eluiert werden.

Wie wird die Immunantwort untersucht?

Die Immunogenität wird in BALB/c-Mäusen geprüft, wobei Blutproben mittels ELISA auf die Reaktivität gegen MSP119 und DsRed analysiert werden.

Welche Rolle spielt das DsRed-Protein?

DsRed dient als Marker- oder Reporterprotein, um die Expression und Akkumulation der Zielproteine in den Pflanzenzellen nicht-invasiv durch Fluoreszenz detektieren zu können.

Wie wird die Stabilität der Proteine sichergestellt?

Es wurde eine Hitzefällung zur Reinigung implementiert und die Temperaturstabilität der Proteine mittels Biacore analysiert, um sicherzustellen, dass die Proteine auch bei höheren Temperaturen ihre konformative Stabilität beibehalten.

Welche spezifischen Antikörper werden zur Untersuchung genutzt?

Es kommen MSP119-spezifische monoklonale Antikörper wie mAb 5.2, 12.8 und 12.10 zum Einsatz, um die Bindungsaffinität und Spezifität der produzierten Fusionsproteine zu bestimmen.