Produktion rekombinanter MSP119-Varianten von Plasmodium falciparum in Nicotiana tabacum zur Evaluierung als Malaria-Impfstoffkandidaten

Inhaltsverzeichnis

• EINLEITUNG
• Der Lebenszyklus von Plasmodium falciparum
• Blutstadien-Antigene und ihre Bedeutung für die Vakzinentwicklung
• Merozoit-Oberflächen-Protein 1
• MSP119 als Impfstoffkandidat
• Die MSP119-spezifischen inhibitorischen mAbs 12.8 und 12.10
• DsRed - Das rot-fluoreszierende Protein
• Pflanzen als Expressionssysteme
• Zielsetzung
• MATERIAL
• Chemikalien und Verbrauchsmaterialien
• Enzyme, Antikörper und Reaktionkits
• Medien, Lösungen und Puffer
• Geräte, Apparaturen und Zubehör
• Vektoren
• Synthetische Gene
• Synthetische Oligonukleotide (Primer)
• Bakterienstämme und Pflanzen
• METHODEN
• Molekularbiolgische Methoden
• Anzucht von E. coli und Herstellung von Stammkulturen
• Hitzeschocktransformation von E. coli
• Kultivierung von A. tumefaciens und Herstellung von Stammkulturen
• Elektroporation von A. tumefaciens
• Plasmidisolation aus E. coli (Minipräparation)
• Restriktion von DNA
• Analytische und präparative Agarosegelelektrophorese
• Analytische Agarosegelelektrophorese
• Präparative Agarosegelelektrophorese
• Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
• Ligation
• Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
• Kolonie-PCR rekombinanter Bakterien
• Enzymatische DNA-Sequenzierung nach Sanger
• Proteinchemische und immunologische Methoden
• Extraktion löslicher Proteine aus Pflanzenmaterial
• Hitzefällung des Pflanzenextraktes
• Reinigung von Proteinen mittels Affinitätschromatographie
• Diskontinuierliche SDS-PAGE
• Sensitive Coomasssie Blue R-250 Färbung
• Western Blot
• Korrelative Proteinquantifizierung mittels Fluoreszenzmessung
• Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Messung (Biacore)
• Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA)
• Pflanzen
• Kultivierung von N. tabacum und N. benthamiana im Gewächshaus
• Transiente Expression in N. tabacum und N. benthamiana
• Immunisierung von Mäusen mit Tabak-produziertem MSP119_3D7-DsRed
• ERGEBNISSE
• Herstellung und Charakterisierung der MSP119-Varianten
• Konstruktion der MSP119-Expressionsvektoren
• Temperaturstabilität von HEK- und Tabak-produziertem MSP119
• Transiente Expression der MSP119-Proteinvarianten in N. tabacum
• Reinigung MSP119-Proteinvarianten
• Charakterisierung der Fusionsproteine auf dem Biacore T100-System
• Immunisierung von Mäusen mit Tabak-produziertem MSP119_3D7-DsRed
• Klonierung und Produktion chimärer Varianten der MSP119-spezifischen inhibitorischen mAbs 12.8 und 12.10
• Konstruktion der Expressionsvektoren für die schwere und leichte Kette der chimären mABs 12.8 und 12.10
• Transiente Expression der chimären Antikörper
• Reinigung der chimären mAbs 12.8 und 12.10
• Charakterisierung der gereinigten chimären Antikörper mAb 12.8 und 12.10 auf dem Biacore T100-System
• DISKUSSION UND AUSBLICK
• Charakterisierung der MSP119-Proteinvarianten
• Charakterisierung der chimären mAbs 12.8 und 12.10

Zielsetzung und Themenschwerpunkte

Die vorliegende Diplomarbeit beschäftigt sich mit der Produktion rekombinanter MSP119-Varianten von Plasmodium falciparum in Nicotiana tabacum zur Evaluierung als Malaria-Impfstoffkandidaten. Ziel der Arbeit ist es, die Eignung von Tabakpflanzen als Expressionssystem für die Herstellung von MSP119-Proteinvarianten zu untersuchen und die erhaltenen Proteine auf ihre Immunogenität und ihre Fähigkeit, die In vitro-Wachstum von Plasmodium falciparum zu hemmen, zu untersuchen.

• Entwicklung von Expressionsvektoren für die Produktion von MSP119-Varianten in Tabakpflanzen
• Charakterisierung der in Tabakpflanzen produzierten MSP119-Varianten hinsichtlich ihrer Struktur, Stabilität und Immunogenität
• Evaluierung der Fähigkeit der MSP119-Varianten, das Wachstum von Plasmodium falciparum in vitro zu hemmen
• Untersuchung der Eignung von Tabakpflanzen als Expressionssystem für die Produktion von rekombinanten Malaria-Impfstoffen

Zusammenfassung der Kapitel

Die Einleitung gibt einen Überblick über den Lebenszyklus von Plasmodium falciparum und die Bedeutung von Blutstadien-Antigenen für die Vakzinentwicklung. Das Merozoit-Oberflächen-Protein 1 (MSP1) wird als vielversprechendes Impfstoffziel vorgestellt. Die Arbeit konzentriert sich auf die MSP119-Region des MSP1, ein wichtiges Epitop, das von inhibitorischen Antikörpern erkannt wird. Es werden verschiedene Ansätze zur Produktion von rekombinanten MSP119-Varianten in Pflanzen, insbesondere Nicotiana tabacum, diskutiert.

Kapitel 2 beschreibt die verwendeten Materialien, inklusive der Vektoren, Gene, Primer und Bakterienstämme. Kapitel 3 erläutert die Methoden, die zur Herstellung und Charakterisierung der MSP119-Varianten eingesetzt werden. Dazu gehören molekularbiologische Methoden wie PCR, Klonierung und Sequenzierung, sowie proteinchemische und immunologische Verfahren wie SDS-PAGE, Western Blot und ELISA. Kapitel 4 präsentiert die Ergebnisse der Arbeit. Es wird gezeigt, dass die MSP119-Varianten erfolgreich in Tabakpflanzen produziert und gereinigt werden konnten. Die charakterisierten Proteine zeigten eine hohe Stabilität und Immunogenität. Schließlich werden die Ergebnisse der Immunisierung von Mäusen mit Tabak-produziertem MSP119_3D7-DsRed vorgestellt.

Schlüsselwörter

Plasmodium falciparum, Malaria, Impfstoff, MSP119, Nicotiana tabacum, rekombinante Proteine, Expressionssystem, Immunogenität, Antikörper, Biacore, ELISA.