Conformación tridimensional y reconocimiento molecular de biopolímeros. Aplicación de RMN multidimensional y desarrollo de metodología de cálculo y estructural

Índice General

1. Introducción General

1.1 Estructura y función en biopolímeros

1.2 Dinámica de biopolímeros

1.3 Refinamiento de estructuras de biopolímeros obtenidas mediante RMN

1.4 Bases de datos estructurales

1.5 Objetivos de la Tesis

2. Homología de la Pc. Synechocistys

2.1 Introducción a la modelización por homología

2.1.1 Generalidades

2.1.2 Alineaciones

2.1.3 Diferentes métodos de modelizar por homología

2.1.4 Modelización por homología mediante satisfacción de restricciones espaciales

2.1.5 Las Plastocianinas

2.1.6 Cinética de reacción de las Plastocianinas

2.2 Materiales y Métodos

2.2.1 El programa MODELLER

2.2.2 Homología utilizando el programa CONGEN

2.2.3 Estructuras plantilla

2.3 Resultados y discusión

2.3.1 Estructuras obtenidas

2.3.2 Análisis de la metodología

2.3.3 Análisis estructural del resultado de homología

2.3.4 Comparación con un triple mutante

2.3.5 Análisis de potencial electrostático

2.4 Conclusiones

3. Estructura 3D de la Pc. Synechocistys

3.1 Introducción

3.1.1 Introducción a la Resonancia Magnética Nuclear

3.1.2 Asignación secuencial

3.1.3 Geometría de distancias. Matriz métrica y función objetivo variable.

3.1.4 Minimización de energía

3.1.5 Dinámica molecular restringida y templado simulado

3.2 Métodos experimentales

3.2.1 Preparación de la muestra

3.2.2 Experimentos de RMN realizados

3.2.3 Restricciones estructurales

3.3 Métodos computacionales

3.3.1 Programa de Procesado de datos de RMN. Gifa.

3.3.2 Geometría de distancias. Programa DIANA.

3.3.3 Refinamiento de estructuras. Templado simulado.

3.4 Resultados y discusión

3.4.1 Asignación secuencial

3.4.2 Estructura secundaria

3.4.3 Conformación de cadenas laterales

3.4.4 Calidad de las estructuras calculadas

3.4.5 Puentes de Hidrógeno

3.4.6 Análisis de la estructura

3.4.7 Comparación con otras estructuras de Plastocianinas

3.4.8 Análisis de potencial electrostático

3.5 Conclusiones

4. Dinámica del wt-BPTI mediante RMN

4.1 Introducción.

4.1.1 Introducción a Dinámica de Proteínas

4.1.2 Aplicación de la Relajación en RMN a dinámica de proteínas

4.1.3 Inhibidor Básico de la Tripsina de Páncreas Bovino

4.2 Métodos

4.2.1 Medida de los parámetros de relajación

4.2.2 El método de minimización. Programa MODELFREE.

4.2.3 Aproximación gráfica

4.2.4 Búsqueda en rejilla

4.2.5 Análisis de densidad espectral reducida

4.3 Resultados y discusión

4.3.1 Resultados de datos simulados

4.3.2 Resultados para el h-TGF-α

4.3.3 wt-BPTI y [C30V,C51A]-BPTI

4.4 Conclusiones

5. Refinamiento de estructuras de RMN mediante restricciones de ángulos diedros. Aportación al programa HYPER.

5.1 Introducción.

5.1.1 Restricciones estructurales

5.1.2 Asignación estereoespecífica

5.2 Métodos.

5.2.1 Cálculo de distancias

5.2.2 Asignación estereoespecífica

5.3 Resultados y discusión

5.3.1 Aplicación de la asignación estereoespecífica a dos proteínas: m-EGF y Dominio Z de la proteína A.

5.3.2 Datos simulados. Geometría ideal

5.3.3 Datos simulados. Estructura de alta resolución de Rayos X.

5.3.4 Datos experimentales de RMN. Dominio Z de la Proteína A

5.3.5 Distancias a N residuos

5.4 Conclusiones

6. Estudio conformacional del CCGCCG

6.1 Introducción.

6.1.1 Estructura del ADN

6.1.2 d(CCGCGG)2

6.1.3 RMN de ácidos nucleicos

6.1.4 Simulación de espectros de RMN

6.2 Material y métodos

6.2.1 Preparación de la muestra

6.2.2 Experimentos realizados

6.2.3 Simulación de picos DQF-COSY

6.2.4 Restricciones estructurales

6.2.5 Cálculo de estructuras

6.2.6 Análisis de las estructuras. NDBSTAT.

6.3 Resultados y discusión

6.3.1 Asignación secuencial

6.3.2 Conformación de los azúcares

6.3.3 Estructuras obtenidas

6.3.4 Comparación con estructura de Rayos X

6.4 Conclusiones

Objetivos y temas de investigación

Esta tesis doctoral tiene como objetivo principal el análisis y perfeccionamiento de las técnicas experimentales y teóricas más comunes empleadas para la determinación de la estructura y dinámica de biopolímeros en disolución, enfocándose en proteínas y ácidos nucleicos mediante el uso de Resonancia Magnética Nuclear y métodos de modelización molecular.

• Modelización estructural por homología aplicada a la Plastocianina Synechocistys.
• Determinación de la estructura tridimensional mediante técnicas de RMN.
• Análisis de la dinámica molecular de proteínas, específicamente el inhibidor BPTI.
• Desarrollo de metodologías de refinamiento estructural basadas en restricciones de ángulos diedros.
• Estudio conformacional de ácidos nucleicos mediante técnicas de RMN y simulación.

Auszug aus dem Buch

Resumen de los capítulos

1 Introducción General: Presenta la importancia de la estructura y dinámica de biopolímeros, justificando el uso de técnicas teóricas y experimentales como la RMN.

2 Homología de la Pc. Synechocistys: Detalla el uso de técnicas de modelización por homología para predecir la estructura de la plastocianina en cianobacterias, comparando los resultados con datos experimentales.

3 Estructura 3D de la Pc. Synechocistys: Describe la determinación experimental de la estructura de la plastocianina mediante RMN bidimensional y técnicas computacionales de refinamiento.

4 Dinámica del wt-BPTI mediante RMN: Analiza los procesos de relajación para comprender la dinámica intramolecular del inhibidor BPTI, comparando la proteína nativa con un mutante específico.

5 Refinamiento de estructuras de RMN mediante restricciones de ángulos diedros. Aportación al programa HYPER: Presenta el desarrollo de una nueva metodología integrada en el programa HYPER para mejorar la precisión estructural mediante restricciones adicionales.

6 Estudio conformacional del CCGCCG: Examina las propiedades estructurales y dinámicas de un hexanucleótido de ADN en disolución mediante RMN, investigando su comportamiento frente a cambios iónicos.

Palabras clave

RMN, Resonancia Magnética Nuclear, proteínas, ácidos nucleicos, Plastocianina, homología, dinámica molecular, relajación, BPTI, modelización, refinamiento estructural, ángulos diedros, ADN, estructura tridimensional, biofísica.

Preguntas frecuentes

¿Cuál es el propósito fundamental de esta tesis?

La investigación se centra en el análisis y la mejora de las metodologías teóricas y experimentales utilizadas para determinar la estructura y dinámica de biopolímeros en disolución, específicamente proteínas y ácidos nucleicos.

¿Qué papel juega la Resonancia Magnética Nuclear (RMN)?

La RMN es una herramienta experimental fundamental para el estudio estructural, permitiendo extraer información sobre distancias, ángulos diedros y dinámicas internas en un entorno biológicamente relevante.

¿Qué es la modelización por homología mencionada en la obra?

Es una metodología teórica que permite predecir la estructura tridimensional de una proteína problema basándose en la similitud estructural con otras proteínas homólogas cuya estructura ya ha sido determinada experimentalmente.

¿Cuál es la importancia del inhibidor BPTI en el estudio de la dinámica?

El BPTI sirve como modelo de estudio exhaustivo debido a su alta estabilidad y a que, a pesar de su tamaño, exhibe muchos de los rasgos dinámicos esenciales presentes en proteínas de mayor complejidad.

¿Cómo contribuye el programa HYPER al refinamiento estructural?

HYPER aporta una metodología novedosa que integra restricciones de ángulos diedros, obtenidos a partir de constantes de acoplamiento escalar y datos de NOE, para lograr una definición estructural más precisa.

¿Por qué se estudia el hexanucleótido d(CCGCGG)2?

Se utiliza para investigar las variaciones conformacionales en el ADN que, dependiendo de factores como la concentración salina, influyen en los mecanismos de reconocimiento molecular.

¿Qué impacto tiene la dinámica sobre la actividad biológica?

El autor argumenta que la flexibilidad y los movimientos atómicos son esenciales para la especificidad y el funcionamiento biológico, superando la visión estática del modelo llave-cerradura.

¿Cómo se abordan los problemas de solapamiento en RMN?

Se utilizan técnicas de RMN bidimensional y, cuando es necesario, el uso de muestras enriquecidas con isótopos específicos (15N, 13C) junto con espectroscopía de RMN-3D para resolver los solapamientos.

¿Qué ventaja ofrece el análisis por densidad espectral reducida?

Este método permite distinguir de forma objetiva entre residuos con movimientos internos lentos y rápidos, proporcionando un análisis dinámico más claro que otros formalismos tradicionales.