Heterologe Expression des Maus Odorant-Bindeproteins 2b

Inhaltsverzeichnis (Table of Contents)

• 1. Einleitung
• 2. Material und Methoden
• 2.1 Materialien
• 2.1.1 Versuchstier (Mus musculus familiaris domesticus)
• 2.1.2 Geräte
• 2.1.3 Chemikalien
• 2.1.3.1 Allgemeine Substanzen
• 2.1.3.2 Spezielle Produkte und Kits für die Molekularbiologie
• 2.1.3.3 Klonierungsvektoren
• 2.1.3.4 Oligonukleotide
• 2.1.3.5 DNA und RNA modifizierende Enzyme
• 2.1.4 Bakterienstämme
• 2.2 Methoden
• 2.2.1 RT-PCR-Analysen
• 2.2.1.1 Gewebepräparation zur RNA-Isolierung
• 2.2.1.2 RNA-Isolation mit NucleoSpin® RNA II-Kit (Macherey-Nagel)
• 2.2.1.3 cDNA-Synthese (Reverse Transkription)
• 2.2.1.4 Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen mit Hilfe der PCR
• 2.2.1.5 Agarose-Gelelektrophorese
• 2.2.1.5.1 Gießen des Agarosegels
• 2.2.1.5.2 Vorbereitung der RT-PCR-Proben
• 2.2.1.5.3 Elektrophoretische Auftrennung der DNA-Fragmente
• 2.2.1.5.4 Sichtbarmachen und Ausschneiden der DNA-Banden
• 2.2.2 Klonierung amplifizierter DNA-Fragmente
• 2.2.2.1 Aufreinigung der DNA aus dem Agarose-Gel
• 2.2.2.2 Restriktionsverdau von Insert und Vektor
• 2.2.2.2.1 Verdau der Vektoren
• 2.2.2.2.2 Verdau der Inserts
• 2.2.2.3 Poly - Adenylierung
• 2.2.2.4 Ligation
• 2.2.2.5 Elektrokompetente Bakterienzellen
• 2.2.2.5.1 Herstellung elektrokompetenter Bakterienzellen
• 2.2.2.5.2 Transformation elektrokompetenter Bakterienzellen
• 2.2.2.6 Chemisch kompetente Bakterienzellen
• 2.2.2.6.1 Herstellung chemisch kompetenter Bakterienzellen
• 2.2.2.6.2 Transformation chemisch kompetenter Bakterienzellen
• 2.2.2.7 Ausplattieren der transformierten Bakterien
• 2.2.2.8 Selektion der Bakterienkolonien
• 2.2.3 Isolierung und Restriktionsanalyse rekombinanter Plasmide
• 2.2.3.1 Minipräparation
• 2.2.3.2 Midipräparation
• 2.2.3.3 Restriktionsanalyse
• 2.2.4 Sequenzierung klonierter DNA
• 2.2.4.1 Sequenzierung
• 2.2.4.2 Analyse der Sequenzdaten
• 2.2.5 Expression und Aufreinigung von mOBP2b
• 2.2.5.1 Expression und Aufreinigung über das Vektorsystem pET22b
• 2.2.5.1.1 Überprüfung der Proteinexpression über IPTG-Induktion
• 2.2.5.1.2 Expression des mOBP2b in E. coli BL21 (PET22b)
• 2.2.5.1.3 Periplasmatische Aufreinigung
• 2.2.5.2 Expression und Aufreinigung über das Vektorsystem pQE-32
• 2.2.5.2.1 Überprüfung der Proteinexpression
• 2.2.5.2.2 Expression des mOBP2b in E. coli BL21 (pQE-32)
• 2.2.5.2.3 His-Tag Aufreinigung über Ni-Affinitätschromatografie
• 2.2.5.3 Charakterisierung der Proteine mit der SDS-PAGE
• 2.2.5.3.1 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
• 2.2.5.3.2 Färbung der Gele mit Coomassie-Brilliant-blue (CBb)
• 3. Ergebnisse
• 3.1 Identifizierung des OBP2b Gens der Maus in der NCBI Gen- Datenbank
• 3.1.1 Identifizierung der Signalsequenz
• 3.2 Oligonukleotid - Primer für die PCR
• 3.2.1 Klonierung in den Vektor pQE-30
• 3.2.1.1 PCR-pQE-30-forward-Primer (G324)
• 3.2.1.2 PCR-pQE-32-reverse-Primer (G325)
• 3.2.2 Klonierung in den Vektor pET-22b (+)
• 3.2.2.1 PCR-pET22b-forward-Primer (G340)
• 3.2.2.2 PCR-PET22b-reverse-Primer (G323)
• 3.3 PCR - Amplifikation der mOBP2b - Gensequenz aus der cDNA
• 3.4 Klonierung in Vektor pGEM-T
• 3.5 Klonierung der Expressionskonstrukte
• 3.5.1 Klonierung in pQE-32
• 3.5.2 Klonierung in pET22b
• 3.6 Expression von mOBP2b in E.coli BL-21
• 3.6.1 Expression über das pET22b-Vektorsystem
• 3.6.1.1 Überprüfung der Expression in E.coli BL21 (pET22b)
• 3.6.1.2 Proteinaufreinigung aus dem pET22b-Expressionssystems
• 3.6.1.2.1 Periplasmatische Aufreinigung
• 3.6.2 Expression über das pQE-32-Vektorsystem
• 3.6.2.1 Überprüfung der Expression in pQE-32
• 3.6.2.2 Proteinaufreinigung aus dem pQE-32-Expressionssystems
• 3.6.2.2.1 Aufreinigung der Bakterienkultur
• 3.6.2.2.2 His-Tag-Proteinaufreinigung über Affinitätschromatografie

Zielsetzung und Themenschwerpunkte (Objectives and Key Themes)

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der heterologen Expression des Maus Odorant-Bindeproteins 2b (mOBP2b). Ziel ist es, das mOBP2b in bakteriellen Expressionssystemen zu produzieren und aufzureinigen, um es anschließend in biochemischen und funktionellen Studien zu untersuchen.

• Heterologe Expression des mOBP2b in Escherichia coli
• Entwicklung geeigneter Expressionsvektoren für die Produktion von mOBP2b
• Optimierung der Expressionsbedingungen und Aufreinigungsprotokolle
• Charakterisierung der exprimierten mOBP2b-Proteine
• Potentielle Anwendungen von mOBP2b in der Geruchswahrnehmung und olfaktorischen Forschung

Zusammenfassung der Kapitel (Chapter Summaries)

Die Einleitung führt in die Thematik der Odorant-Bindeproteine (OBPs) und ihre Rolle in der Geruchswahrnehmung ein. Sie beschreibt die Bedeutung von mOBP2b im olfaktorischen System der Maus und die Notwendigkeit, dieses Protein in ausreichender Menge für weitere Untersuchungen zu gewinnen.

Kapitel 2 beschreibt die verwendeten Materialien und Methoden. Es beinhaltet detaillierte Informationen über die eingesetzten Versuchstiermodelle, Geräte, Chemikalien, Bakterienstämme und die verwendeten molekularbiologischen Verfahren. Die Kapitel 2.2.1-2.2.5 befassen sich mit den einzelnen Schritten der mOBP2b-Expression und -Aufreinigung, beginnend mit der RNA-Isolierung und der cDNA-Synthese, über die PCR-Amplifikation, Klonierung und Transformation bis hin zur Expression und Aufreinigung des Zielproteins.

Kapitel 3 präsentiert die erzielten Ergebnisse. Es beschreibt die Identifizierung des OBP2b-Gens in der NCBI Gen-Datenbank, die Konstruktion von Expressionsvektoren und die Expression des mOBP2b in Escherichia coli. Die Ergebnisse der Proteinaufreinigung und Charakterisierung werden ebenfalls vorgestellt.

Schlüsselwörter (Keywords)

Odorant-Bindeproteine (OBPs), Maus Odorant-Bindeprotein 2b (mOBP2b), Heterologe Expression, Escherichia coli, Expressionsvektoren, Proteinaufreinigung, Ni-Affinitätschromatographie, SDS-PAGE, Geruchssignale, Olfaktorisches System, Geruchswahrnehmung, Biochemische und funktionelle Studien.