Kohlenstoffisotopenfraktionierung beim PCE- und TCE-Abbau durch Rohextrakte von Sulfurospirillum spp. Untersuchungen an dehalogenierenden Anreicherungskulturen aus Bitterfeld

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

2. Material und Methoden

2.1. Verwendete Chemikalien

2.2. Kulturen

2.3. Kultivierung der Mikroorganismen

2.3.1. Zusammensetzung der verwendeten Kulturmedien

2.3.2. Kultivierung von Sulfurospirillum spp.

2.3.3. Kultivierung der Anreicherungskulturen aus Bitterfeld

2.4. Herstellung des Rohextrakts

2.4.1. Kultivierung und Zellyse

2.4.2. Bestimmung der Aktivität des Rohextrakts

2.5. Experimente zur Isotopenfraktionierung

2.5.1. Versuchsaufbau Isotopenfraktionierung durch Rohextrakte

2.6. Bestimmung des Fraktionierungsfaktors αC

2.6.1. Analyse des Isotopenverhältnisses

2.6.2. Bestimmung der Konzentration der chlorierten Ethene

2.6.3. Berechnung des Fraktionierungsfaktors αC

2.7. Untersuchung der Anreicherungskulturen aus Bitterfeld

2.7.1. Extraktion der Gesamt-DNS aus den Anreicherungskulturen

2.7.2. PCR mit RDase-Primern für Dehalococcoides spp.

2.7.3. Anfertigung einer Klonbank, Kolonie-PCR und Restriktonsanalyse

2.7.4. Sequenzierung

3. Ergebnisse

3.1. Fraktionierungsexperimente mit Rohextrakten von Sulfurospirillum spp.

3.1.1. Rohextrakte von S. multivorans mit TCE im Medium

3.1.2. Rohextrakte von S. multivorans mit TCE und Fumarat im Medium

3.1.3. Rohextrakte von S. multivorans mit Fumarat im Medium

3.1.4. Rohextrakte von S. halorespirans mit PCE im Medium

3.1.5. Rohextrakte von S. halorespirans mit TCE im Medium

3.2. Untersuchung der Anreicherungskulturen aus Bitterfeld

3.2.1. Beobachtung der Dechlorierung und Kohlenteilstoffbilanz

3.2.2. Kolonie-PCR und Restriktionsanalyse der putativen Dehalogenasen

3.2.3. Sequenzierung ausgewählter Inserts

3.2.4. Mikroskopisch-morphologische Beobachtung

4. Diskussion

4.1. Ursachen der Isotopenfraktionierung

4.1.1. Isotopenfraktionierung durch Rohextrakte von S. multivorans

4.1.2. Isotopenfraktionierung durch Rohextrakte von S. halorespirans

4.1.3. Kinetische Hemmung durch die Zellbarrieren und ihr Einfluß auf den Isotopeneffekt

4.1.4. Reaktionsmechanismus – Einfluß auf die Isotopendiskriminierung

4.2. Anreicherung von dechlorierenden Mikroorganismen aus Bitterfeld

Zielsetzung & Themen

Die Arbeit untersucht den Einfluss der bakteriellen Zellstruktur (Membran und Zellwand) auf die Fraktionierung stabiler Kohlenstoffisotope beim anaeroben Abbau von Tetrachlorethylen (PCE) und Trichlorethylen (TCE) durch Rohextrakte der Spezies Sulfurospirillum multivorans und S. halorespirans. Ziel ist es, die Rolle von Transportprozessen und zellulären Barrieren im Vergleich zu enzymspezifischen Reaktionsmechanismen zu identifizieren und gleichzeitig dehalogenierende Mikroorganismen aus kontaminierten Proben in Bitterfeld anzureichern.

• Kinetische Isotopenfraktionierung bei der reduktiven Dehalogenierung.
• Einfluss von Zellmembranen und Barrieren auf die Isotopendiskriminierung.
• Vergleich der Reaktionsmechanismen bei PCE und TCE unter Verwendung von Rohextrakten.
• Anreicherung und genetische Charakterisierung dehalogenierender Mikroorganismen aus dem Standort Bitterfeld.

Auszug aus dem Buch

Zusammenfassung der Kapitel

1. Einleitung: Beschreibt die Zielsetzung der Untersuchung des Einflusses bakterieller Zellstrukturen auf die Kohlenstoffisotopenfraktionierung beim Abbau von PCE und TCE.

2. Material und Methoden: Detaillierte Darstellung der chemischen Ausgangsstoffe, der Kultivierungsmethoden der verwendeten Bakterienstämme sowie der experimentellen Aufbauten zur Messung von Aktivität und Fraktionierungsfaktoren.

3. Ergebnisse: Präsentation der experimentellen Daten zu den Fraktionierungsexperimenten mit Rohextrakten sowie Ergebnisse der mikrobiellen Anreicherung aus dem kontaminierten Bitterfelder Standort.

4. Diskussion: Interpretation der Ergebnisse hinsichtlich der Reaktionsmechanismen, des Einflusses der Zellbarrieren und der genetischen Identifikation potenzieller dehalogenierender Enzyme.

Schlüsselwörter

Tetrachlorethylen, Trichlorethylen, Isotopenfraktionierung, Sulfurospirillum multivorans, Sulfurospirillum halorespirans, Rohextrakte, reduktive Dehalogenierung, Zellmembran, Kohlenstoffisotope, Dehalococcoides, Bitterfeld, Kinetik, Anreicherungskultur, Bioremediation, Isotopendiskriminierung

Häufig gestellte Fragen

Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?

Die Arbeit erforscht, wie bakterielle Zellstrukturen wie Membranen und Zellwände die Fraktionierung von stabilen Kohlenstoffisotopen während des enzymatischen Abbaus von chlorierten Ethenen beeinflussen.

Was sind die zentralen Themenfelder?

Die zentralen Felder umfassen die mikrobiologische Dehalogenierung, Isotopengeochemie, Membranbiologie sowie die funktionelle Analyse von Mikroorganismengemeinschaften aus kontaminierten Standorten.

Was ist das primäre Ziel oder die Forschungsfrage?

Die Forschungsfrage zielt darauf ab zu klären, ob die Unterschiede in der Isotopenfraktionierung bei PCE und TCE eher durch kinetische Barrieren an der Zellmembran oder durch enzymspezifische Mechanismen der reduktiven Dehalogenierung bedingt sind.

Welche wissenschaftliche Methode wird verwendet?

Es kommen unter anderem anaerobe Kultivierungsmethoden, Isotopenmassenspektrometrie (GC-C-IRMS), Proteinbestimmungen nach Bradford sowie molekularbiologische Verfahren wie PCR und Restriktionsanalysen zur Anwendung.

Was wird im Hauptteil behandelt?

Der Hauptteil gliedert sich in Fraktionierungsexperimente mit Rohextrakten, die den Einfluss von Wachstumssubstraten prüfen, sowie die mikrobielle Anreicherung und genetische Untersuchung von Kulturen aus dem Bitterfelder Grundwasser.

Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?

Die Arbeit wird durch Begriffe wie PCE, TCE, Isotopenfraktionierung, Sulfurospirillum, Dehalococcoides und reduktive Dehalogenierung charakterisiert.

Welche Rolle spielt die Zellwand bei der Isotopenfraktionierung?

Die Zellwand kann als kinetische Barriere fungieren, die den Transport zum Enzym einschränkt und so das isotopische Gleichgewicht beeinflussen oder vermindern kann.

Warum wurde Bitterfeld als Untersuchungsstandort gewählt?

Bitterfeld ist ein industriell kontaminierter Standort, dessen Grundwasser ein interessantes Spektrum an chlorierten Lösungsmitteln aufweist, die als Basis für die Anreicherung dehalogenierender Kulturen dienen.

Was unterscheidet Rohextrakte von intakten Zellen in dieser Untersuchung?

In Rohextrakten sind die Zellwände und Membranen zerstört, wodurch Transportvorgänge, die in intakten Zellen die Fraktionierung beeinflussen könnten, eliminiert werden und die enzymatische Reaktion isoliert betrachtet werden kann.