Sequenzierung und Charakterisierung der Triosephosphat-Isomerase aus Tenebrio molitor (Mehlwurm)

Inhaltsverzeichnis

• Aufgabenstellung
• Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Einleitung
  • Rolle der TIM im Stoffwechsel
  • Regulation der Glycolyse
  • Triosephosphat-Isomerase in Insekten
  • Struktur der Triosephosphat-Isomerase
    • Aktives Zentrum
  • TIM-Genomorganisation (Introns und Exons)
    • Frühe-Intron-Theorie
    • Späte-Intron-Theorie
  • Sequenzierungsmöglichkeiten
  • Rekombinante Expression
  • Wahl des Organismus
• Material
  • Geräte
  • Fein- und Biochemikalien
  • Verbrauchsmaterialien
  • Puffer
    • Standardpuffer
    • Puffer für Agarosegelelektrophorese
    • Puffer für die Aktivitätsbestimmung
    • Puffer für Einschlusskörper-Reinigung
    • Puffer für Polyacrylamidgelelektrophorese
    • Puffer für Affinitätschromatographie
      • Ni-NTA-Säule
      • 9E10-Säule
  • Kits
  • Primer
  • Vektoren
  • Proteine
  • Stämme
  • Marker
  • Präparat
  • Medien
  • Software
• Methoden
  • Nukleinsäure-Analytik
    • RNA-Präparation
    • cDNA-Synthese
    • cDNA-Amplifikation
    • Gelelektrophorese
    • PCR-Reinigung
    • Amplifikation der TIM-Sequenz
    • DNA-Präparation und Sequenzierung
    • RACE-PCR
  • Konstruktion, Transformation und Expression
    • PGP-S100 Vektor
      • Ligation und Transformation
      • Expression
    • PGP-ST2 Vektor
      • Ligation und Transformation
      • Expression
    • PCR T7/NT Vektor
      • Konstruktion und Reinigung des Inserts
      • Ligation und Transformation
      • Expression
  • Zellaufschluss
    • French Press
    • Ultraschall
  • Aktivitätsbestimmung
  • Proteinfraktionierung
    • Probenvorbereitung
    • Totallysat
    • Lösliche und unlösliche Proteine
    • Periplasma-Gewinnung
    • Einschlusskörper-Reinigung
  • Proteinreinigung (Affinitätschromatographie)
    • Ni-NTA-Säule mit Stufenelution (pGP ST2)
    • Ni-NTA-Säule mit linearer Elution (pCR NT/T7)
    • 9E10-Säule mit einfacher Elution (pCR NT/T7)
  • Proteinanalytik
    • SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
    • Western-Blot
    • Coomassieblue-Färbung
• Ergebnisse und Diskussion
  • RNA-Präparation
  • Sequenzierung der Triosephosphat-Isomerase
    • Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)
    • Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
    • Reinigung, Minipräparation und Restriktionsanalyse
    • Sequenzierergebnis
    • Sequenzierung der DNA
    • Intronvergleich
    • 5/3'-Rapid Amplification of either 5' or 3' cDNA Ends-Polymerase Kettenreaktion
      • 5' RACE-PCR
      • 5' Nested-PCR
      • 3'-RACE-PCR
  • Vektorenauswahl und Konstruktion der Inserts
    • Konstruktion des Inserts für den PGP-S100-Vektor
    • Konstruktion des Inserts für den pGP-ST2-Vektor
    • Konstruktion des Inserts für den pCR-NT/T7-Vektor
  • Expression in verschiedenen Systemen
    • Expression in XL1 E.coli Zellen mit dem pGP-S100-Vektor
    • Expression in XL-1 E.coli Zellen mit dem pGP-ST2-Vektor
    • Affinitätschromatographie an der Ni-NTA-Säule
    • Expression in BL21(DE3) pLysS E.coli Zellen mit dem pCR-T7/NT-Vektor
    • Affinitätschromatographie an der Ni-NTA-Säule
    • Affinitätschromatographie an der 9E10 Säule
  • Charakterisierung der Triosephosphat-Isomerase
    • Aktivitätsbestimmung
    • Strukturmodellierung
    • Strukturvergleich
  • Abschlußdiskussion
• Literatur

Zielsetzung und Themenschwerpunkte

Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Sequenzierung und Charakterisierung der Triosephosphat-Isomerase (TIM) aus dem Mehlkäfer Tenebrio molitor. Ziel ist es, die Introns im Gen zu lokalisieren, ein vollständiges Protein codierendes Gen zu konstruieren und dieses anschließend in einem Vektor zu klonieren. Darüber hinaus soll das exprimierte Protein gereinigt und seine Aktivität bestimmt werden.

• Sequenzierung und Charakterisierung der Triosephosphat-Isomerase aus Tenebrio molitor
• Lokalisierung von Introns im TIM-Gen
• Rekombinante Expression des TIM-Proteins
• Reinigung und Aktivitätsbestimmung des rekombinanten TIM-Proteins
• Vergleich der TIM-Sequenz mit bekannten TIM-Sequenzen aus anderen Organismen

Zusammenfassung der Kapitel

• Kapitel 1: Aufgabenstellung: Dieses Kapitel definiert die Ziele der Arbeit, darunter die Sequenzierung der TIM aus Tenebrio molitor, die Lokalisierung von Introns im Gen und die rekombinante Expression des Proteins.
• Kapitel 2: Zusammenfassung: Bietet eine kurze Zusammenfassung der wichtigsten Ergebnisse der Arbeit.
• Kapitel 3: Abkürzungsverzeichnis: Erläutert die Abkürzungen, die im Text verwendet werden.
• Kapitel 4: Einleitung: Gibt einen Überblick über die Rolle der TIM im Stoffwechsel, die Regulation der Glycolyse, die TIM in Insekten und die Struktur der TIM. Es werden außerdem die frühen und späten Intron-Theorien sowie verschiedene Möglichkeiten zur Sequenzierung und rekombinanten Expression diskutiert.
• Kapitel 5: Material: Beschreibt die Geräte, Fein- und Biochemikalien, Verbrauchsmaterialien, Puffer, Kits, Primer, Vektoren, Proteine, Stämme, Marker, Präparate, Medien und Software, die in der Arbeit verwendet wurden.
• Kapitel 6: Methoden: Detaillierte Beschreibung der Methoden, die in der Arbeit angewendet wurden, einschließlich Nukleinsäure-Analytik, Konstruktion, Transformation und Expression, Zellaufschluss, Aktivitätsbestimmung, Proteinfraktionierung und Proteinreinigung.
• Kapitel 7: Ergebnisse und Diskussion: Präsentiert die Ergebnisse der Arbeit, darunter die Sequenzierung der TIM, die Konstruktion von Expressionsvektoren, die Expression des Proteins in verschiedenen Systemen, die Reinigung des Proteins und die Charakterisierung seiner Aktivität.

Schlüsselwörter

Triosephosphat-Isomerase, Tenebrio molitor, Sequenzierung, Klonierung, rekombinante Expression, Introns, Proteinreinigung, Aktivitätsbestimmung, Strukturmodellierung.