Aufklärung der Struktur-Wirkungsbeziehungen von CpG-A- und CpG-C-Oligodesoxynukleotiden als Grundlage für die Entwicklung immunstimulatorischer Nanopartikel

Inhaltsverzeichnis

• EINLEITUNG
• Das humane Immunsystem
• Die angeborene und die adaptive Immunität
• Toll-like Rezeptoren - Erkennungssysteme der angeborenen Immunität
• Typ-l Interferon - ein Effektor der angeborenen Immunität
• Dendritische Zellen - Mittler zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunität
• B-Zellen - Effektorzellen der adaptiven Immunität
• CpG-Oligodesoxynukleotide
• Geschichtlicher Hintergrund: Von bakteriellen Lysaten zu synthetischer CpG-DNA
• Wirkung und Wirkmechanismen von CpG-DNA
• Definition von drei Klassen synthetischer CpG-ODN: CpG-A, CpG-B und CpG-C
• Therapeutischer Einsatz von CpG-Oligodesoxynukleotiden
• Ziele dieser Arbeit
• MATERIAL UND METHODEN
• Geräte, Chemikalien und Reagenzien
• Geräte
• Verbrauchsmaterialien
• Chemikalien
• Reagenziensätze
• Materialien für die Zellkultur
• Zytokine
• Zellkulturmedien, Puffer und Lösungen
• Medien und Puffer für die Zellkultur
• Puffer und Lösungen für die Gelelektrophorese
• Antikörper für die Durchflusszytometrische Analyse
• Oligodesoxynukleotide
• Zur Zellstimulation eingesetzte Sequenzen
• Zur Gelelektrophorese eingesetzte Sequenzen
• Temperatur-Präinkubation von ODN 2216
• Temperatur-Präinkubation von ODN M362
• Polyvalente Linker
• Polyvalente Linker - CpG-DNA
• Trivalente Linker - palindromische RNA
• Poly-L-Arginine als Transfektionsreagenzien
• Herstellung des , Master-Mixes' zur Transfektion
• Zellulär - immunologische Methoden
• Isolation der gewünschten Zellpopulation
• Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes
• Plasmazytoide dendritische Zellen
• Gesamt B-Zellen (CD19⁺)
• Herstellung autologen Serums
• Zellkultur
• Durchflusszytometrie (FACS-Analyse)
• Grundprinzip der FACS-Analyse
• Durchflusszytometrische Bestimmung der Reinheit von plasmazytoiden dendritischen Zellen und B-Zellen
• Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
• Zytokine
• Proliferation (BrdU-ELISA)
• Molekularbiologische Methoden
• Gelelektrophorese
• Prinzip der Gelelektrophorese
• Prinzip der Detektion von Digoxigenin-markierten Oligodesoxynukleotiden
• Prinzip der Detektion von DNA durch Ethidiumbromidfärbung
• Durchführung der Gelelektrophorese
• Blotting und Detektion Digoxigenin-markierter Oligodesoxynukleotide
• Färbung mit Ethidiumbromid
• Auswertung der Gelbilder
• Partikelgrößenbestimmung durch Zetapotenzialmessung
• Grundprinzip
• Durchführung der Messung
• Statistische Analyse
• Software
• ERGEBNISSE
• Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehungen von CpG-A und CpG-C
• Untersuchung des Klasse A Oligodesoxynukleotids 2216
• CpG-A bildet Nanopartikel im Größenbereich von Viren
• Entwicklung der Temperatur-Präinkubationsmethode zur experimentellen Kontrolle der Multimerisierungen
• Strukturelle Analyse: CpG-A multimerisiert im physiologischen Milieu
• Identifizierung des zentralen Palindroms als notwendiges Element zum Aufbau größerer Partikel aus G-Tetraden
• Identifizierung der Natriumionen als wichtiges stabilisierendes Element zum Aufbau der G-Tetraden
• Große Partikel sind die Voraussetzung zur raschen Induktion hoher Mengen von Interferon-alpha in plasmazytoiden dendritischen Zellen
• Die Präinkubation von PDCs mit Interferon-beta verstärkt die Induktion von Interferon-alpha durch Einzelstränge
• B-Zellen werden von kleinen Partikeln und Einzelsträngen des ODN 2216 nicht aktiviert
• Strukturelle Analyse: Die Multimere öffnen ihre Bindungen bei < 37 °C
• Untersuchung des Klasse C Oligodesoxynukleotids M362
• Strukturelle Analyse bei 4 °C: Die Stabilität der Duplices hängt von den anwesenden Natrium- oder Magnesiumionen ab
• Strukturelle Analyse bei 37°C: Weder Duplices noch Hairpins sind im physiologischen Milieu stabil
• Übertragung der Ergebnisse der strukturellen Analyse auf den Zellversuch
• Design immunstimulatorischer Partikel unter Einsatz wirksamer Strukturelemente von CpG-A und CpG-C
• Polyvalente Linker - palindromische CpG-DNA
• Strukturelle Analyse
• Starke Induktion von Interferon-alpha in PBMCs nach Transfektion mit Poly-L-Arginin
• Screening verschieden langer Poly-L-Arginine als Transfektionsreagenzien

Zielsetzung und Themenschwerpunkte

Die vorliegende Dissertation befasst sich mit der Aufklärung der Struktur-Wirkungsbeziehungen von CpG-A- und CpG-C-Oligodesoxynukleotiden. Ziel ist es, die Erkenntnisse für die Entwicklung immunstimulatorischer Nanopartikel zu nutzen.

• Das humane Immunsystem und dessen Funktionsweise
• Die Rolle von CpG-Oligodesoxynukleotiden in der Immunantwort
• Strukturelle Eigenschaften von CpG-A und CpG-C und ihre Auswirkungen auf die Immunstimulation
• Die Entwicklung und Charakterisierung von immunstimulatorischen Nanopartikeln
• Therapeutische Anwendungsmöglichkeiten von CpG-basierten Nanopartikeln

Zusammenfassung der Kapitel

Die Einleitung stellt das humane Immunsystem und die Rolle von CpG-Oligodesoxynukleotiden in der Immunantwort vor. Sie definiert zudem die drei Klassen synthetischer CpG-ODN: CpG-A, CpG-B und CpG-C. Abschließend werden die Ziele der Arbeit erläutert.

Kapitel 2 beschreibt die verwendeten Materialien und Methoden. Es werden die Geräte, Chemikalien, Reagenzien, Oligodesoxynukleotide, polyvalente Linker, zellulär-immunologischen und molekularbiologischen Methoden sowie die statistische Analyse erläutert.

Kapitel 3 präsentiert die Ergebnisse der Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehungen von CpG-A und CpG-C. Es wird die Multimerisierung des Klasse A Oligodesoxynukleotids 2216 untersucht und die Bildung von Nanopartikeln im Größenbereich von Viren festgestellt. Darüber hinaus wird die Induktion von Interferon-alpha durch CpG-A in plasmazytoiden dendritischen Zellen analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass große Partikel von CpG-A die rasche Induktion von Interferon-alpha bewirken. Abschließend werden die strukturellen Eigenschaften des Klasse C Oligodesoxynukleotids M362 untersucht und die Ergebnisse in den Kontext der Zellversuche gesetzt.

Kapitel 4 behandelt die Entwicklung immunstimulatorischer Partikel unter Einsatz wirksamer Strukturelemente von CpG-A und CpG-C. Es werden polyvalente Linker - palindromische CpG-DNA - verwendet, um Nanopartikel zu konstruieren, die eine starke Induktion von Interferon-alpha in PBMCs nach Transfektion mit Poly-L-Arginin bewirken.

Schlüsselwörter

CpG-Oligodesoxynukleotide, Immunstimulation, Nanopartikel, Interferon-alpha, plasmazytoide dendritische Zellen, B-Zellen, Struktur-Wirkungsbeziehung, G-Tetraden, Palindrome, Poly-L-Arginine, Transfektion.