Molekulare Analyse der Expression des TNF-Rezeptors 2 in der humanen Brustkrebszellinie MCF-7 nach Applikation von Antiestrogenen

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG

1.1 Steroidhormone

1.1.1 Estrogene

1.1.1.1 Estrogenabhängige Tumore

1.1.1.2 Antiestrogene

1.2 Apoptose

1.2.1 Signaltransduktion apoptotischer Prozesse

1.2.1.1 Tumor-Nekrosis-Faktor α (TNFα)

1.2.1.2 TNF-Rezeptoren

1.3 Zielsetzung

2 MATERIAL UND METHODEN

2.1 Zellkultur

2.1.1 Zellinien

2.1.2 Kulturbedingungen

2.1.3 Passagieren der Zellen

2.1.4 Hormonbehandlung

2.2 RNA-Präparation

2.2.1 RNA-Präparation mittels Trizol®

2.2.2 Quantifizierung von Nukleinsäuren

2.2.3 DNase-Verdau

2.3 Semiquantitative PCR (Diel et al. 1996; Murphy et al., 1990)

2.3.1 Ableiten der Primer

2.3.2 cDNA-Synthese

2.3.3 PCR (Mullis et al., 1987)

2.3.4 Gelelektrophorese der PCR-Fragmente (Sambrock et al., 1989)

2.3.5 Dokumentation der Gele

2.4 Proteinisolierung aus MCF-7 Zellen

2.4.1 Proteinisolierung

2.4.2 Konzentrationsbestimmung

2.5 Western-Blot

2.5.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Laemmli, 1970)

2.5.2 Coomassie-Brilliant-Blue Färbung (Frazekas et al., 1963)

2.5.3 Semi-dry Blotting (Towbin et al., 1979)

2.5.4 Antikörperinkubation

2.5.5 Proteinnachweis durch das Lumi-LightPlus System

2.6 Material

2.6.1 Laborgeräte

2.6.2 Chemika lien

2.6.3 PCR Primer

2.6.4 Enzyme, Kits und weitere Materialien

2.6.5 Antikörper

3 ERGEBNISSE

3.1 Proteinisolierung aus Faslodex behandelten MCF-7 Zellen

3.1.1 Konzentrationsbestimmung der löslichen Proteinfraktionen

3.1.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese der Proteinproben

3.2 Western-Blot Analyse der Regulation des TNF-Rezeptors 2

3.3 Quantitative Analyse der mRNA-Expression mittels RT-PCR

3.3.1 Visuelle Qualitätskontrolle der isolierten RNA

3.3.2 RNA Präparation aus Faslodex behandelten MCF-7 Zellen

3.4 Semiquantitative PCR

4 DISKUSSION

4.1 MCF-7 Zellen als Modellsystem

4.2 Regulation des TNF-Rezeptors 2 nach Faslodex-Applikation

4.2.1 Western-Blot-Analyse

4.2.2 Semiquantitative PCR

4.2.3 Mechanismus der Regulation des TNF-Rezeptors 2

4.3 Funktion von TNF-R2 im Rahmen der Apoptoseinduktion

5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK

Zielsetzung & Themen

Diese Arbeit untersucht den Einfluss des Antiestrogens Faslodex auf die Expression des TNF-Rezeptors 2 in humanen Brustkrebszellen der Linie MCF-7. Das Ziel ist es, durch molekularbiologische Methoden wie Western-Blot-Analyse und semiquantitative RT-PCR zu klären, wie Faslodex die Regulation dieses Rezeptors beeinflusst, um den Mechanismus der Apoptoseinduktion besser zu verstehen.

• Charakterisierung und Quantifizierung der TNF-Rezeptor 2 Expression
• Etablierung der Western-Blot-Analyse für das untersuchte Modellsystem
• Analyse der mRNA-Regulation mittels semiquantitativer PCR
• Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Faslodex-Behandlung und apoptotischen Signalwegen

Auszug aus dem Buch

Zusammenfassung der Kapitel

1 EINLEITUNG: Grundlagen zu Steroidhormonen, der Rolle von Estrogenen bei Tumoren sowie eine Einführung in die Apoptose und die TNF-Rezeptor-Signalwege.

2 MATERIAL UND METHODEN: Detaillierte Beschreibung der Zellkultur, RNA-Präparation, semiquantitativen PCR und Western-Blot-Protokolle zur Untersuchung von MCF-7 Zellen.

3 ERGEBNISSE: Präsentation der experimentellen Daten zur Proteinisolierung und Analyse der TNF-R2 Expression nach Faslodex-Behandlung mittels Western-Blot und RT-PCR.

4 DISKUSSION: Interpretation der Befunde, insbesondere zur Regulation des TNF-Rezeptors 2 und dessen funktioneller Rolle bei der Apoptoseinduktion in Tumorzellen.

5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK: Zusammenfassende Bewertung der Ergebnisse und Vorschläge für zukünftige Forschungsansätze zur Resistenzbildung.

Schlüsselwörter

Faslodex, MCF-7, Brustkrebszellen, TNF-Rezeptor 2, Apoptose, Western-Blot, semiquantitative PCR, mRNA-Expression, Antiestrogene, Signaltransduktion, NF-κB, Tumortherapie, Rezeptorregulation.

Häufig gestellte Fragen

Worum geht es in der Arbeit grundlegend?

Die Arbeit untersucht den molekularen Einfluss des Antiestrogens Faslodex auf die Regulation und Expression des TNF-Rezeptors 2 in der Brustkrebszelllinie MCF-7.

Welche Themenfelder werden zentral behandelt?

Die zentralen Themen sind endokrine Tumortherapie, Mechanismen des programmierten Zelltods (Apoptose), sowie molekularbiologische Analysemethoden von Proteinen und mRNAs.

Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?

Das primäre Ziel ist die Charakterisierung und Quantifizierung der Proteinexpression des TNF-Rezeptors 2 unter dem Einfluss von Faslodex, um mögliche Regulationsmechanismen aufzudecken.

Welche wissenschaftlichen Methoden werden verwendet?

Es kommen insbesondere die Western-Blot-Analyse zur Bestimmung der Proteinkonzentration und -identität sowie die semiquantitative RT-PCR zur mRNA-Analyse zum Einsatz.

Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?

Der Hauptteil gliedert sich in eine detaillierte methodische Beschreibung der durchgeführten Laboranalysen sowie die anschließende Auswertung der Ergebnisse hinsichtlich der TNF-R2 Regulation.

Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?

Zu den wichtigsten Begriffen zählen Faslodex, MCF-7, TNF-Rezeptor 2, Apoptose, Western-Blot und Signaltransduktion.

Welche Bedeutung hat das Faslodex-induzierte 80 kDa Protein?

Es wird vermutet, dass dieses Protein der TNF-Rezeptor 2 ist, da es durch Faslodex stark induziert wird und in seinem Molekulargewicht mit Literaturangaben für diesen Rezeptor übereinstimmt.

Warum konnte die Regulation auf mRNA-Ebene nicht eindeutig verifiziert werden?

Die Ergebnisse der RT-PCR waren nicht eindeutig, was auf nicht optimale Amplifikationsbedingungen oder die Notwendigkeit einer Optimierung der Primer-Konzentrationen hindeutet.