Aktivierung von Cyclophosphamid in Extrakten aus embryonalen Hühnerlebern

Inhaltsverzeichnis

• Einleitung
  • Tierversuche, Ersatz- und Ergänzungsmethoden
  • Untersuchung von Metabolisierungswegen durch die Nutzung hepatischer Funktionen für in- vitro Verfahren
  • Die Entwicklung des Hühnerembryos
  • Entwicklung der embryonalen Hühnerleber
  • Cytochrom P 450 und die Biotransformation von Fremdstoffen
    • Cytochrom P 450
    • Biotransformation von Fremdstoffen
    • Biotransformation von Cyclophosphamid
      • Cyclophosphamid
      • Metabolismus von Cyclophosphamid
  • Ziel der Arbeit
• Materialien und Methoden
  • Materialien
    • Cyclophosphamid (Reaktant)
    • Acrolein (Produkt)
    • Sonstige Chemikalien
    • Biologisches Material
  • Methoden
    • Die Herstellung des gebrauchsfertigen Leberextraktes
      • Inkubation der Eier und Entnahme der Lebern
      • Extraktion und Fraktionierung des Lebergewebes
    • Pre-Test: Bestimmung der De-O-Ethylase-Aktivität des gewonnenen Leberextraktes mit Ethoxycoumarin
      • Bestimmung von Hydroxy- und Ethoxycoumarin im Fluoreszenzspektrometer
      • Durchführung des Enzymtests mit Ethoxycoumarin
      • Differentielle Extraktion von Ethoxy- und Hydroxycoumarin
    • Quantitative Bestimmung von Acrolein
      • Herstellung von Stammlösungen
      • Herstellung eines Derivatisierungsreagenzes zur fluorimetrischen Bestimmung von Acrolein
      • Die Derivatisierung von Acrolein zu 7- Hydroxychinolin und Herstellung von Eichkurven
      • Bestimmung von Acrolein mittels Messungen am Fluorimeter
      • Durchführung des Enzymtests zur Aktivierung von Cyclophosphamid
      • Neutralisieren der Enzymansätze
      • Extraktion von 7- Hydroxychinolin aus derivatisierten und neutralisierten Enzymansätzen
      • Bestimmung von Acrolein durch Dünnschichtchromatographie und densitometrische Auswertung der Chromatogramme
      • Proteinbestimmung nach Bradford
• Ergebnisse
  • Aktivitätstest für Cytochrom P 450 mit 7- Ethoxycoumarin
    • Fluoreszenz von Ethoxy- und Hydroxycoumarin
    • Quantitative Bestimmung der Aktivität von Cytochrom P 450 mittels Messung der De-O-Ethylierung von Ethoxycoumarin zu Hydroxycoumarin
  • Kalibrierung der Fluoreszenzsignale von 7- Hydroxychinolin, dem Derivatisierungsprodukt aus Acrolein und 3- Aminophenol
    • Fluoreszenz von 7- Hydroxychinolin im Fluorimeter
    • Fluoreszenz von 7- Hydroxychinolin nach Dünnschichtchromatographie und Auswertung am Densitometer
  • Neutralisation der Derivatisierungsansätze
    • Entwicklung einer Methode zur Isolierung von 7- Hydroxychinolin aus sauren Ansätzen mittels Neutralisation und anschließender Extraktion
    • Extraktion von 7- Hydroxychinolin aus sauren und neutralisierten Derivatisierungsansätzen
  • Erfassung von Acrolein in Ansätzen mit Leberextrakt
    • Abhängigkeit der nachgewiesenen Acroleinmengen vom Volumen des eingesetzten Leberextraktes
    • Erfassung von Acrolein bei konstantem Volumen Leberextrakt im Enzymansatz
    • Auswirkung der Inkubationszeit auf die Erfassung von Acrolein
  • Aktivierung von Cyclophosphamid und Nachweis des Aktivierungsproduktes Acrolein mittels Dünnschichtchromatographie und densitometrischer Auswertung der Chromatogramme
    • Quantitativer Nachweis von Acrolein als Metabolisierungsprodukt von Cyclophosphamid in Abhängigkeit von der Zeit
• Diskussion
• Zusammenfassung

Zielsetzung und Themenschwerpunkte

Diese Arbeit befasst sich mit der Aktivierung des Medikaments Cyclophosphamid durch Extrakte aus embryonalen Hühnerlebern. Im Fokus steht die Entwicklung einer Methode zur quantitativen Bestimmung eines Aktivierungsproduktes, Acrolein.

• Entwicklung einer Methode zur Aktivierung von Cyclophosphamid durch Extrakte aus embryonalen Hühnerlebern
• Quantitative Bestimmung des Aktivierungsproduktes Acrolein
• Untersuchung des Metabolismus von Cyclophosphamid durch Cytochrom P 450
• Anwendung von in-vitro Verfahren zur Untersuchung von Metabolisierungswegen
• Einsatz von Hühnerembryonen als Modell für die Untersuchung von Leberfunktionen

Zusammenfassung der Kapitel

Die Einleitung der Arbeit erläutert die Bedeutung von Tierversuchen und stellt alternative Methoden vor. Sie führt in die Untersuchung von Metabolisierungswegen mit Hilfe von in-vitro Verfahren ein und beschreibt die Entwicklung des Hühnerembryos und der embryonalen Hühnerleber. Des Weiteren wird das Enzym Cytochrom P 450 und dessen Rolle bei der Biotransformation von Fremdstoffen, insbesondere Cyclophosphamid, beleuchtet. Die Zielsetzung der Arbeit wird dargelegt.

Das Kapitel "Materialien und Methoden" beschreibt die verwendeten Materialien und detailliert die einzelnen Schritte des Experiments. Dies umfasst die Herstellung des Leberextraktes, die Durchführung von Aktivitätstests für Cytochrom P 450, die quantitative Bestimmung von Acrolein sowie die Durchführung des Enzymtests zur Aktivierung von Cyclophosphamid.

Die Ergebnisse der Arbeit werden im Kapitel "Ergebnisse" präsentiert. Die Aktivität von Cytochrom P 450 wird mit Hilfe von Ethoxycoumarin gemessen und die Fluoreszenzsignale von 7-Hydroxychinolin, dem Derivatisierungsprodukt von Acrolein, werden kalibriert. Die Neutralisation der Derivatisierungsansätze und die Erfassung von Acrolein in Ansätzen mit Leberextrakt werden beschrieben. Die Aktivierung von Cyclophosphamid und der Nachweis von Acrolein als Metabolisierungsprodukt werden mit Hilfe von Dünnschichtchromatographie und densitometrischer Auswertung der Chromatogramme dargestellt.

Schlüsselwörter

Die Arbeit fokussiert auf die Aktivierung von Cyclophosphamid, die Entwicklung einer Methode zur quantitativen Bestimmung des Aktivierungsproduktes Acrolein, die Anwendung von in-vitro Verfahren zur Untersuchung von Metabolisierungswegen, das Enzym Cytochrom P 450, die Biotransformation von Fremdstoffen, embryonale Hühnerlebern und Dünnschichtchromatographie.