Die Evolution der Glucose-6-phosphat Isomerase und des cystolischen sowie plastidären Stoffwechselwegs zur Isoprenoid-Biosynthese

Inhaltsverzeichnis

• Einleitung
• Die Endosymbionten-Theorie
• Die Evolution eukaryotischer Algen Primäre und sekundäre Endosymbiose
• Der Ursprung komplexer Algen mit rotem Plastiden - "Chromista" und Alveolata
• Die Haptophyten
• Die Diatomeen
• Proteintransport über Plastidenmembranen
• Proteinimport in die komplexen Plastiden der Diatomee Phaeodactylum tricornutum
• Die Glucose-6-phosphat Isomerase als wirtszell-spezifischer Marker der Evolution
• Biosynthese von Isopentenyl Pyrophosphat (IPP)
• Der Mevalonat (MVA)-Weg der IPP-Biosynthese
• Der Methylerythritol Phosphat (MEP)-Weg der IPP-Biosynthese
• Verbreitung von MVA- und MEP-Pathway
• Zielsetzung dieser Arbeit
• Material und Methoden
• Geräte
• Verbrauchsmaterialien, Chemikalien und Enzyme
• Kommerzielle Reagenzsätze (Kits)
• Arbeiten mit E. coli
• Plasmid- und Bakteriophagen-Vektoren
• In dieser Arbeit verwendetes Algen-Zellmaterial
• Herkunft des Algenmaterials
• Kultivierung der in dieser Arbeit verwendeten Algenspezies
• Arbeiten mit Nukleinsäuren
• Standard-Methoden beim Arbeiten mit DNA
• Isolierung von Gesamt-DNA aus Phaeodactylum tricornutum
• Arbeiten mit RNA
• Grundlagen des Arbeitens mit RNA
• Isolation von Gesamt-RNA aus verschiedenen Algenspezies
• Konzentrationsmessung von RNA-Präparationen
• Aufreinigung von poly(A)*-RNA aus verschiedenen Algenspezies
• RT-PCR Experimente zur partiellen Amplifikation von Transkripten für die GPI, den cytosolischen und den plastidären Weg der IPP-Biosynthese
• Erstellung von Aminosäure-Alignments zur Konzeption degenerierter Primer
• Konzeption degenerierter Primer zur Amplifikation unbekannter Transkripte der GPI und der Gene der IPP-Biosynthesewege
• Konzeption sequenzspezifischer Primer zur Amplifikation von Transkripten der GPI und der IPP-Biosynthese
• Durchführung von RT-PCR Experimenten
• Screening von genomischen und cDNA-Banken zur Isolierung von Genen für die GPI, die DXR und die HMGR
• Sequenzierung von DNA
• Untersuchung der subzellulären Lokalisation von Proteinen der IPP-Biosynthesewege in Phaeodactylum tricornutum
• Der Phaeodactylum Transformations-Vektor pPha-T1
• Herstellung von eGFP-Reportergen-Konstrukten zur Untersuchung der Lokalisation der DXS, DXR und HMGR in Phaeodactylum
• Stabile genetische Transformation von Phaeodactylum mittels Helium-Partikel-Kanone
• Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung und fotografische Dokumentation transformierter Phaeodactylum-Zellen mittels eines konfokalen Laserscanning Mikroskops
• Nachweis der Reportergen-Konstrukte in transformierten Phaeodactylum-Zellen
• Phylogenetische Analysen
• Ergebnisse
• In silico Etablierung von Referenz-Sequenzen und Erstellung von Aminosäure-Alignments
• Konzeption degenerierter Primer zur Amplifikation von unbekannten Genfragmenten
• Die Verbreitung der Glucose-6-phosphat Isomerase in den Plantae, den Alveolata und den "Chromista"

Zielsetzung und Themenschwerpunkte

Diese Dissertation untersucht die Evolution der Glucose-6-phosphat Isomerase (GPI) und des cytosolischen sowie plastidären Stoffwechselwegs zur Isoprenoid-Biosynthese in eukaryotischen Algen. Dabei werden molekulare, zellbiologische und phylogenetische Analysen von Genen des eukaryotischen Primärstoffwechsels durchgeführt.

• Evolution des eukaryotischen Primärstoffwechsels
• Analyse von Genen der Glucose-6-phosphat Isomerase
• Untersuchung des cytosolischen und plastidären Stoffwechselwegs zur Isoprenoid-Biosynthese
• Phylogenetische Analysen von Algenarten
• Proteintransport über Plastidenmembranen

Zusammenfassung der Kapitel

Die Einleitung gibt einen Überblick über die Endosymbionten-Theorie und die Evolution eukaryotischer Algen, insbesondere die Haptophyten und Diatomeen. Des Weiteren werden die Proteintransportmechanismen über Plastidenmembranen und die Glucose-6-phosphat Isomerase als wirtszell-spezifischer Marker der Evolution diskutiert. Abschließend wird die Biosynthese von Isopentenyl Pyrophosphat (IPP) und die Verbreitung des Mevalonat (MVA)- und Methylerythritol Phosphat (MEP)-Weges beschrieben.

Das Kapitel "Material und Methoden" beschreibt die verwendeten Materialien, Geräte und Methoden, wie z.B. Arbeiten mit E. coli, Plasmiden und Bakteriophagen-Vektoren, Isolierung von Nukleinsäuren, RT-PCR Experimente, Screening von genomischen und cDNA-Banken, Sequenzierung von DNA, Untersuchung der subzellulären Lokalisation von Proteinen und phylogenetische Analysen.

Das Kapitel "Ergebnisse" präsentiert die in silico Etablierung von Referenz-Sequenzen und die Konzeption degenerierter Primer zur Amplifikation von unbekannten Genfragmenten. Des Weiteren werden die Ergebnisse zur Verbreitung der Glucose-6-phosphat Isomerase in den Plantae, den Alveolata und den "Chromista" dargestellt.

Schlüsselwörter

Die Dissertation befasst sich mit der Evolution des eukaryotischen Primärstoffwechsels, insbesondere der Glucose-6-phosphat Isomerase, der Isoprenoid-Biosynthese und dem Proteintransport über Plastidenmembranen. Wichtige Themen sind die Endosymbionten-Theorie, phylogenetische Analysen, Haptophyten, Diatomeen, Plantae, Alveolata, "Chromista", Mevalonat (MVA)-Weg, Methylerythritol Phosphat (MEP)-Weg und RT-PCR Experimente.