Klonierung eines genomischen DNA-Fragments mit für Lamin C codierenden Sequenzen

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

2. Material

2.1 Chemikalien

2.2 Vektoren und Bakterienstämme

2.2.1 λ−Phage EMBL3 und E.coli-Stamm P2392

2.2.2 Plasmidvektor Bluescript und E.coli K12-Stamm DH5α

2.3 Zusammensetzung häufig verwendeter Puffer und Medien

2.4 Partiell verdaute DNA von EAT-Zellen

2.5 Lamin C-cDNA-Sonden

3. Methoden

3.1 Konstruktion einer genomischen Sequenzbank

3.1.1 Ligation von EAT-DNA-Fragmenten mit EMBL3 Phagenarmen

3.1.2 In vitro-Verpackung von rekombinierter Phagen-DNA

3.1.3 Präparation von E. coli-Zellen für die Infektion mit λ−Phagen

3.1.4 Infektion von E. coli-Zellen mit λ−Phagen

3.1.5 Konzentrationsbestimmung von λ−Phagen in Suspension

3.1.6 Amplifikation der Stammsequenzbank

3.2 Identifizierung von rekombinierten λ−Phagen

3.2.1 Herstellen von Replikas

3.2.2 Radioaktive Markierung von Lamin C-cDNA mit [α-32P]dCTP

3.2.3 TCA-Präzipitation

3.2.4 Hybridisierung der Nylonmembranblots

3.2.5 Autoradiographie

3.2.6 Anreicherung, Selektion und Amplifikation von vereinzelten λ−Phagenklonen

3.3 Umklonieren von genomischen DNA-Fragmenten aus dem EMBL3-Phagen in den Bluescriptvektor

3.3.1 DNA-Isolierung aus λ-Phagen

3.3.2 DNA-Konzentrationsbestimmung

3.3.3 Restriktionsendonukleaseverdau

3.3.4 Agarose-Gelelektrophorese

3.3.5 Southernblot

3.3.6 Gewinnung der genomischen DNA-Fragmente aus dem EMBL3-Phagenklon

3.3.7 Präparation des Bluescriptvektors für die Ligation

3.3.8 Ligation in den Bluescriptvektor

3.3.9 Herstellung von transformationskompetenten E. coli-Zellen

3.3.10 Transformation von E.coli mit rekombinierten Bluescriptvektoren

3.3.11 Isolierung von Plasmid-DNA

4. Ergebnisse

4.1 Nachweis der Lokalisation des Lamin C-Gens zwischen zwei genomischen Eco RI-Schnittstellen

4.2 Etablierung einer repräsentativen genomischen Sequenzbank

4.3 Identifizierung eines rekombinanten Klons Embl3gLCM

4.4 Identifizierung des Genfragments mit für Lamin C codierenden Sequenzen auf dem Phagenklon Embl3gLCM

4.5 Umklonierung des Eco RI-Sal I-Fragments in den Bluescriptvektor

4.6 Umklonierung des Eco RI-Eco RI-Fragments in den Bluesciptvektor

5. Diskussion

6. Zusammenfassung

Zielsetzung & Themen

Das Hauptziel dieser Arbeit ist die Schaffung eines Forschungsansatzes zur Untersuchung der genomischen Organisation der Kernlamine. Dabei soll insbesondere ein Klon identifiziert und isoliert werden, der DNA-Sequenzen enthält, die für das Lamin C-Gen codieren.

• Erstellung einer repräsentativen genomischen Sequenzbank in λ-Phagen auf Basis von Ehrlich-Ascites-Tumorzellen der Maus.
• Identifizierung und Isolierung eines spezifischen Phagenklons (Embl3gLCM) mit Lamin C-codierenden Sequenzen mittels Hybridisierung.
• Charakterisierung und Eingrenzung der codierenden Sequenzen durch Restriktionsanalyse.
• Umklonierung der identifizierten DNA-Fragmente in Plasmidvektoren (Bluescript) zur Amplifikation und weiteren Untersuchung.

Auszug aus dem Buch

Zusammenfassung der Kapitel

1. Einleitung: Die Einleitung gibt einen Überblick über die Bedeutung der DNA, die Entwicklung der Molekulargenetik und die biologische Rolle der Lamine als Intermediärfilamente in der Kernhülle.

2. Material: Dieses Kapitel listet die verwendeten Chemikalien, Enzyme, Vektoren und Bakterienstämme sowie die Zusammensetzung der verwendeten Pufferlösungen auf.

3. Methoden: Hier werden die experimentellen Schritte zur Konstruktion der Genom-Bank, zur Identifizierung der Phagenklone, zum Southernblot sowie zur Klonierung in Bluescript-Plasmide detailliert beschrieben.

4. Ergebnisse: Dieses Kapitel präsentiert den Nachweis der Genlokalisation, die Etablierung der Genom-Bank sowie die erfolgreiche Identifizierung und Umklonierung des Lamin C-Gensegments.

5. Diskussion: Die Diskussion reflektiert die Ergebnisse der Arbeit und bewertet die Eignung der gewählten Methode zur Aufklärung der genomischen Organisation der Lamingene.

6. Zusammenfassung: Hier werden die wichtigsten erzielten Ergebnisse und der wissenschaftliche Fortschritt der Arbeit in fünf zentralen Punkten zusammengefasst.

Schlüsselwörter

Genomische DNA, Lamin C, Ehrlich-Ascites-Tumorzellen, EAT, λ-Phage EMBL3, Bluescriptvektor, Klonierung, Restriktionsendonukleasen, Southernblot, Hybridisierung, cDNA-Sonde, Molekularbiologie, Genexpression, Intermediärfilamente, Genbank.

Häufig gestellte Fragen

Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?

Die Arbeit befasst sich mit der molekularbiologischen Untersuchung der genomischen Organisation von Laminen, einer speziellen Proteinfamilie der Kernhülle, bei Mäusen.

Was sind die zentralen Themenfelder der Publikation?

Im Zentrum stehen die Klonierung von genomischen DNA-Fragmenten, die das Lamin C-Gen der Maus enthalten, sowie die Untersuchung derer struktureller Organisation.

Was ist das primäre Ziel oder die Forschungsfrage?

Das Ziel war es, Voraussetzungen zu schaffen, um Lamingene bzw. für Lamine codierende DNA-Sequenzen (speziell das Lamin C-Gen) aus dem Genom der Maus zu isolieren und zu charakterisieren.

Welche wissenschaftliche Methode wurde verwendet?

Es wurden klassische molekularbiologische Techniken wie die Konstruktion einer genomischen Genbank in λ-Phagen, Hybridisierung mit radioaktiv markierten Sonden, Southernblot-Analysen und das Umklonieren in Plasmidvektoren angewendet.

Was wird im Hauptteil behandelt?

Der Hauptteil beschreibt detailliert die Vorbereitung der DNA, die Identifizierung der spezifischen Phagenklone, die Klonierung der Fragmente in Bluescript-Vektoren und die experimentelle Validierung der Ergebnisse durch Restriktionsanalysen.

Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?

Die Arbeit ist durch Begriffe wie Genomik, Lamin-Klonierung, λ-Phagen-Technologie, Blau-Weiß-Selektion und molekulare Charakterisierung von Tumorzell-DNA geprägt.

Was bedeutet "Embl3gLCM" in diesem Kontext?

Es handelt sich um den spezifischen Phagenklon, der aus der Genbank isoliert wurde und die genomische Sequenz des Lamin C-Gens der Maus im Vektor EMBL3 enthält.

Warum wurden gerade Ehrlich-Ascites-Tumorzellen (EAT) als Material gewählt?

EAT-Zellen sind ein gut untersuchtes Tumorsystem, bei dem bekannt ist, dass die Lamine B und C in signifikanten Mengen exprimiert werden, was sie zu einem idealen Modell für diese molekulargenetische Untersuchung macht.