Identifikation von Promotorelementen, die zu einer CAR-abhängigen Induktion von INDY führen. Nachweis der funktionellen Relevanz

Inhaltsverzeichnis

I. Einleitung

I.1 Molekulare Mechanismen kalorischer Restriktion und Langlebigkeit

I.2 Das Indy-Gen und seine Funktion im Zustand kalorischer Restriktion

I.2.1 Struktur und Funktion des Indy-Genprodukts

I.2.2 Zusammenhang zwischen Indy-Expression und Lebenserwartung

I.3 Die Rolle von CAR und PPARα im Energiemetabolismus

I.4 Ziel der Arbeit

II. Material und Methoden

ZELLBIOLOGISCHE METHODEN

II.1 Isolierung und Reinigung von Hepatozyten nach Meredith

II.2 Hepatozytenkultivierung

II.2.1 Puffer und Lösungen

II.2.2 Durchführung der Hepatozytenkultivierung

II.3 Transfektion von primären Rattenhepatozyten

II.3.1 Puffer und Lösungen

II.3.2 Prinzip

II.3.3 Transfektionscocktail

II.3.4 Durchführung der Transfektion primärer Hepatozyten

II.4 Stimulation von primären Rattenhepatozyten mit Phenobarbital und WY14643

II.4.1 Puffer und Lösungen

II.4.2 Stimulation primärer Hepatozyten

MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN

II.5 Isolierung von Gesamt-RNA

II.5.1 Puffer und Lösungen

II.5.2 RNA-Isolierung

II.6 Synthese von cDNA-mRNA-Hybriden

II.6.1 Puffer und Lösungen

II.6.2 Synthese von cDNA

II.7 Real-Time-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)

II.7.1 Puffer und Lösungen

II.7.2 Grundprinzip der RT-qPCR

II.7.3 Durchführung der RT-qPCR

II.8 Agarosegel-Elektrophorese

II.8.1 Puffer und Lösungen

II.8.2 Auftrennung der DNA im Agarosegel

II.8.3 Isolierung von DNA aus Agarosegel

II.9 Umklonierung der rIndy-Promotorfragmente aus pGL3-basic in den Vektor pGL4.83

II.9.1 Prinzip

II.9.2 Puffer und Lösungen

II.9.3 Ligation der rIndy-Promotorfragmente mit pGL4.83

II.10 Transformation der pGL4.83 - rIndyprom- Plasmide in E.coli XL-1 Zellen durch Elektroporation

II.10.1 Puffer und Lösungen

II.10.2 Transformation kompetenter E.coli XL-1 Zellen durch Elektroporation

II.11 Analyse rekombinanter Bakterienkolonien durch Plasmidpräparation im Mini-Maßstab

II.11.1 Puffer und Lösungen

II.11.2 Reinigung von Plasmid-DNA durch Affinitäts-Chromatographie im Mini-Maßstab

II.12 Charakterisierung von Plasmid-DNA durch Restriktionsspaltung

BIOCHEMISCHE METHODEN

II.13 Messung der Luciferase-Reportergenaktivität

II.13.1 Puffer und Lösungen

II.13.2 Grundprinzip des Luciferase Assay

II.13.3 Durchführung des Luciferase-Assays

II.13.4 Proteinbestimmung nach Bradford

II.14 Messung des Citrattransports in primäre Hepatozyten der Ratte

II.14.1 Puffer und Lösungen

II.14.2 Durchführung der Citrattransportstudie

III. Ergebnisse

III.1 Regulation der Indy und Cyp2B1 mRNA in Rattenhepatozyten durch PB und WY14643

III.1.1 Induktion der Cyp2B1 mRNA

III.1.2 Induktion der Indy mRNA

III.2 Regulation der Cyp2B10 und Indy mRNA in mHC durch PB und WY14643

III.2.1 Induktion der Cyp2B10 bei C57B/6 Mäusen

III.2.2 Induktion der Indy mRNA bei C57B/6 Mäusen

III.2.3 Induktion der Cyp2B10 und Indy mRNA in 129SV Mäusen

III.3 Regulation der Aktivität von Indy- und Cyp2B1-Reportergenkonstrukten durch PB und WY14643 in Rattenhepatozyten

III.3.1 Aktivierung des Cyp2B1-Promotors und der Indy-Promotorfragmente

III.4 Umklonierung der rIndy-Promotorfragmente in Renilla Luciferasevektor

III.5 Regulation der Aktivität von Indy Reportergenkonstrukten durch PB und WY14643 mit Renilla-Luciferase als Reportergen

III.6 Modulation der Firefly-Luciferase mRNA in Rattenhepatozyten durch PB und WY1463

III.7 Regulation des 14C-Citrattransports in Rattenhepatozyten durch PB und WY14643

IV. Diskussion

IV.1 Einfluss von PB und WY 14643 auf die Cyp2B- und Indy Expression in Ratten- und Maushepatozyten

IV.1.1 Wirkung von PB und WY 14643 auf die Cyp2B1-Expression in Rattenhepatozyten

IV.1.2 Wirkung von PB und WY 14643 auf die Indy-Expression in Rattenhepatozyten

IV.1.3 Einfluss von PB und WY 14643 auf den Citrattransport

IV.1.4 Vergleich der Indy- und Cyp2B-Regulation in Maus – und Rattenhepatozyten

IV.2 Mögliche physiologische Relevanz einer Regulation von Indy durch die Transkriptionsfaktoren CAR und PPARα

IV.3 Luciferase als Reportergen bei der Untersuchung PB-abhängigen Aktivierung von Promotoren

IV.4 Schlussfolgerung

Zielsetzung & Themen

Die Arbeit untersucht den Einfluss der Transkriptionsfaktoren CAR und PPARα auf die Regulation des Langlebigkeitsgens "Indy" in Säugetierhepatozyten, um die molekularen Mechanismen der kalorischen Restriktion besser zu verstehen. Mittels Reportergen-Analysen und Transportstudien wird geprüft, ob Indy als Zielgen dieser Faktoren fungiert und wie sich dessen Expression auf den Citrattransport auswirkt.

• Molekulare Mechanismen der kalorischen Restriktion
• Indy-Genregulation durch CAR und PPARα
• Vergleichende Analyse in Ratten- und Maushepatozyten
• Methodische Validierung von Luciferase-Reportergenen
• Einfluss auf den metabolischen Citrattransport

Auszug aus dem Buch

Zusammenfassung der Kapitel

I. Einleitung: Beschreibt die physiologischen Grundlagen der kalorischen Restriktion, die Bedeutung des Indy-Gens und die Rolle nukleärer Rezeptoren wie CAR und PPARα im Energiestoffwechsel.

II. Material und Methoden: Detailliert die zellbiologischen, molekularbiologischen und biochemischen Verfahren, einschließlich der Hepatozytenisolierung, Transfektionsmethoden und Reportergen-Assays.

III. Ergebnisse: Präsentiert die experimentellen Daten zur mRNA-Regulation von Indy und Cyp2B1 durch Phenobarbital und WY14643 sowie die Analysen der Promotoraktivitäten.

IV. Diskussion: Interpretiert die Ergebnisse bezüglich der CAR-abhängigen Indy-Regulation und diskutiert die physiologische Relevanz sowie die methodischen Herausforderungen bei der Nutzung von Luciferase als Reportergen.

Schlüsselwörter

Kalorische Restriktion, Indy-Gen, CAR, PPARα, Hepatozyten, Phenobarbital, WY14643, Genregulation, Reportergen-Assay, Citrattransport, Langlebigkeit, Fastenadaptation, Transkriptionsfaktoren, mRNA-Expression, Zellstoffwechsel

Häufig gestellte Fragen

Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?

Die Arbeit befasst sich mit der Identifikation von Promotorelementen des Indy-Gens und der Untersuchung einer CAR-abhängigen Induktion von Indy in Säugetierhepatozyten.

Welche zentralen Themenfelder werden behandelt?

Die zentralen Felder sind die kalorische Restriktion, die Genregulation durch nukleäre Rezeptoren (CAR, PPARα) sowie der Energiestoffwechsel in der Leber.

Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?

Ziel ist es, den Einfluss der Transkriptionsfaktoren CAR und PPARα auf die Indy-Genregulation zu klären und zu prüfen, ob Indy als Zielgen für diese Faktoren in Betracht kommt.

Welche wissenschaftlichen Methoden kommen zum Einsatz?

Die Arbeit nutzt unter anderem primäre Hepatozytenkulturen, RT-qPCR zur mRNA-Quantifizierung, Luciferase-Reportergen-Assays zur Promotoranalyse sowie Studien zum 14C-Citrattransport.

Was behandelt der Hauptteil?

Der Hauptteil ist in Material und Methoden sowie die Ergebnisse unterteilt, welche die Regulation von Indy und Vergleichsgenen wie Cyp2B1 in Ratten- und Mausmodellen experimentell nachweisen.

Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?

Wichtige Begriffe sind Kalorische Restriktion, Indy-Gen, CAR, PPARα, Hepatozyten und Genregulation.

Wie unterscheidet sich die Indy-Regulation zwischen Ratten und Mäusen?

Obwohl Indy in beiden Spezies durch Phenobarbital induziert wird, konnte die Induktion in Rattenhepatozyten durch WY14643 signifikant verstärkt werden, was in Maushepatozyten nicht beobachtet wurde.

Warum wurde die Luciferase-Reportergenanalyse normalisiert?

Da Phenobarbital einen unspezifischen hemmenden Effekt auf die Firefly-Luciferaseaktivität zeigte, war eine Normalisierung mit SV40-Promotor-Konstrukten notwendig, um echte regulatorische Effekte zu isolieren.

Welche funktionelle Relevanz hat die Regulation von Indy?

Die Regulation könnte zur Versorgung des Organismus mit gluconeogenetischen Substraten während des Fastenzustands beitragen und so den Energiehaushalt stabilisieren.